Universität zu Köln

Krüppel, Ulla (2007). Regulation der HPV16-Genexpression durch E2, E6 und zelluläre Faktoren. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Zusammenfassung Die Abhängigkeit des Lebenszyklus der Papillomviren (PV) von differenzierenden Keratinozyten der Haut oder der Schleimhaut, wird auf Ebene der Transkription determiniert. Neben Keratinozyten-spezifischen und ubiquitär exprimierten Transkriptionsfaktoren wird die Genexpression auch vom viral kodierten Transkriptionsfaktor E2 kontrolliert. Die Hauptfunktion von E2 bei humanen PV (HPV), die die Mukosa infizieren, scheint eine Repression der Expression der viralen Onkogene E6 und E7 zu sein. In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass geringe E2-Mengen den frühen HPV16 Promotor (P97) deutlich aktivieren, wenn der zellulärer Ko-Aktivator p300 überexprimiert wird. Dies erfordert die Bindung von E2 an mindestens zwei seiner vier Bindestellen (BS) innerhalb der LCR sowie Sequenzen 3´ des P97 bis Nt. 523. In dieser Arbeit wurde eine Bindung des zellulären Transkriptionsfaktors C/EBPa in vitro und in vivo an die Sequenz von Nt. 469-488 nachgewiesen. Diese neu identifizierte BS ist notwendige Voraussetzung für eine kooperative Aktivierung durch E2 und p300. Gleichzeitig wird durch die Bindung von C/EBPα an diese BS ein weiterer, nicht näher charakterisierter, Promotor reprimiert. C/EBPa und p300 kooperieren bei der Aktivierung des P97. Dies erfordert neben der sequenzspezifischen Bindung von C/EBPa an die BS 469 auch die Histon-Acetytransferase-Domäne von p300. Die Stimulation des P97 durch p300, E2 und/oder C/EBPα führt zu einer vermehrten Expression der Onkogene E6 und E7. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass 16E6 im Bereich des P97 gebunden vorliegt und in der Lage ist, den frühen Promotor auf Ebene der Transkription zu reprimieren. Im Rahmen der Aktivierung der Transkription induziert C/EBPα eine Phosphorylierung des C-Terminus seines Ko-Aktivators p300. Die Menge an phosphoryliertem p300 war in Gegenwart von 16E6 reduziert. Die Verwendung spezifischer Inhibitoren ergab, dass eine Staurosporine-inhibierbare Kinase und ein Faktor, der proteasomal abgebaut wird, daran beteiligt sind. Die transkriptionelle Repression wird zusätzlich durch zwei voneinander unabhängig agierende Domänen des E6-Proteins vermittelt: zum Einen durch die N-terminale Hälfte von 16E6 (As. 1-84) in Verbindung mit Domänen im C-Terminus, zum Anderen durch das C-terminale, unter mukosalen Hochrisiko-HPV-Typen konservierte PDZ-Bindemotiv. Die Deletion dieser Motive führte zu keiner verminderten Menge an phosphoryliertem p300. Experimente mit HPV-positiven Zervixkarzinomzelllinien, in denen das HPV-Genom integriert vorliegt, lieferten keine Hinweise auf eine Autoregulation durch E6. 16E6, exprimiert von episomalem HPV-Genom, trägt hingegen zur Kontrolle seiner eigenen Expression bei, so dass E6 die Vollendung des viralen Lebenszyklus unterstützen und das Risiko einer Transformation verringern könnte. Dieser Mechanismus ist möglicherweise im Verlauf der Karzinogenese verloren gegangen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Regulation of HPV16-genexpression by E2, E6 and cellular proteins English
Translated abstract:	Abstract Language Abstract The life cycle of papillomaviruses (PV) depends on the differentiating keratinocytes of the skin or mucosa and is determined at the level of transcription. Gene expression is controlled by keratinocyte-specific and ubiquitously expressed transcription factors as well as the virally encoded E2 protein. It seems that the main function of the E2 protein of human PV (HPV) that infect the mucosa is repression of the expression of the E6 and E7 oncogenes. Previous work revealed that low amounts of E2 can activate the HPV16 early promoter (P97) when its co-activator p300 is overexpressed. This requires E2 binding to at least two of four binding sites (BS) localized in the LCR as well as sequences up to position 523. This work demonstrates that the cellular transcription factor C/EBPa binds to the sequence at pos. 469-488 in vitro and in vivo. This newly identified BS is a prerequisite for cooperative activation of P97 by E2 and p300. The binding of C/EBPα to this site represses another yet unidentified HPV16 promoter. C/EBPa and p300 cooperate to activate the P97. In addition to a sequence-specific binding of C/EBPα to BS 469, activation requires the histone acetyltransferase domain of p300. The stimulation of the P97 by p300 and E2 and/or C/EBPa leads to increased expression of the E6 and E7 oncogenes. This work shows, that the 16E6 protein is present near the promoter region and is able to repress its own transcription. During activation of transcription, C/EBPα induces phosphorylation of the C-terminal part of its co-activator p300. The amount of phosphorylated p300 is reduced in the presence of 16E6. This 16E6 effect was alleviated by kinase- and proteosomal inhibitors. The results identified the involvement of a staurosporine-dependent kinase and a factor, that is degraded via the proteasome. In addition, transcriptional repression was mediated by two other independently acting domains, which are the E6 N-terminal moiety (aa.1-84) in combination with C-terminal parts and a C-terminal PDZ-binding motif, which is conserved among high risk mucosal E6 proteins. The deletion of these motifs did not reduce the amount of phosphorylated p300. Experiments with HPV-positive cervical carcinoma cell lines, which harbour integrated HPV genomes, revealed no hints of this kind of autoregulation by E6. These data suggest that E6 expressed from episomal genomes contributes to regulation of its own expression. Such regulation might support the completion of the viral life cycle and reduce the risk of transformation. This mechanism may be lost during the course of carcinogenesis. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Krüppel, Ulla ulla.krueppel@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-22913
Date:	2007
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Virologie > Institut für Virologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language p300 C/EBP E2 E6 HPV16 German p300 C/EBP E2 E6 HPV16 English
Date of oral exam:	10 February 2008
Referee:	Name Academic Title Pfister, Herbert Prof. Dr. Dr. hc
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2291