Analysis of Rca1 function at the G1-S transition in Drosophila melanogaster

Querings, Silvia (2008). Analysis of Rca1 function at the G1-S transition in Drosophila melanogaster. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Tight control of APC/C-Cdh1Fzr activity is essential for progression through mitosis and establishment of the G1 phase. Rca1 is a nuclear protein that inhibits the APC/C-Cdh1Fzr complex during G2 to allow cyclin accumulation and subsequent entry into mitosis. In this thesis, a localisation study of Rca1 was performed revealing that a nuclear localisation sequence (NLS) and other domains in the protein mediate efficient nuclear accumulation. Besides its function in G2, Rca1 expression can promote S phase entry. Rca1 belongs to the family of F-box proteins that mediate substrate specificity in SCF (Skp-Cul1-F-box) ubiquitin ligases. Functional studies demonstrated that the F-box is crucial for S phase induction by Rca1, suggesting that Rca1 has a secondary function in an SCF complex. A major part of this thesis was devoted to characterise the putative SCF/Rca1 complex and its target proteins. In a yeast two-hybrid screen, the SCF subunit SkpA was identified as a binding partner of Rca1. Coimmunoprecipitation studies confirmed this interaction and indicated moreover that SkpA binding relies on the F-box in Rca1. Furthermore, endogenous Cul1 coprecipitated with Rca1 and this also in an F-box dependent manner. Altogether, these experiments demonstrated that Rca1 forms a complex with the SCF core subunits SkpA and Cul1. The SCF/Rca1 complex could promote S phase entry by degrading a negative regulator of the G1-S transition. Cyclin A/Cdk1 is a potent S phase inducer, but its activity is normally dampened by the CKI Rux, inhibitory phosphorylation by Wee and APC/C-Cdh1Fzr dependent degradation of Cyclin A. Protein levels of these S phase inhibitors were not altered by coexpression of Rca1 suggesting that these proteins are not targets of the SCF/Rca1 complex. Overexpression of Rca1 in larval salivary glands results in impaired endoreplication and accumulation of Cyclin A, Cyclin E and Cdk1. Expression profiling revealed that mitotic genes (e.g. Cyclin A/B, Cdk1) are normally downregulated in salivary glands, but ectopic Rca1 expression promotes transcription of these genes. In addition, qRT-PCR analysis showed elevated transcript levels of the E2F1 targets Rnr2 and PCNA, suggesting that Rca1 overexpression leads to increased E2F1 activity. Cyclin E is also a known E2F1 target and hence, this might explain the marked increase in Cyclin E transcript levels. Finally, the gene expression analysis indicated that components of the APC/C and its target Geminin were present in larval salivary glands, thus supporting the idea that rereplication in endoreplicating cells is controlled by Geminin and the APC/C-Cdh1Fzr complex.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Funktionale Analysen von Rca1 am G1-S Übergang in Drosophila melanogaster	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Für den korrekten Ablauf der Mitose und die Etablierung der G1 Phase ist eine strikte Kontrolle der APC/C-Cdh1Fzr Aktivität notwendig. Rca1 ist ein Kernprotein, das den APC/C-Cdh1Fzr Komplex während der G2 Phase inhibiert und somit eine Akkumulation der Cycline sowie den Eintritt in die Mitose ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Studie zur Lokalisation von Rca1 durchgeführt, in der gezeigt werden konnte, dass eine Kernlokalisierungssequenz sowie weitere Domänen im Protein eine effiziente Kernakkumulation vermitteln. Außer der Funktion in der G2 Phase, kann die Expression von Rca1 auch den Eintritt in die S Phase beschleunigen. Rca1 gehört zur Familie der F-box Proteine, welche Substratspezifität in SCF (Skp-Cul1-F-box) Ubiquitinligasen vermitteln. Funktionale Studien konnten zeigen, dass die F-box in Rca1 für die Induktion von S Phasen notwendig ist und führten zur Annahme einer sekundären Funktion von Rca1 in einem SCF Komplex. Ein großer Teil dieser Arbeit umfasste die Charakterisierung des besagten putativen SCF/Rca1 Komplexes sowie seiner Substrate. Die SCF Untereinheit SkpA wurde in einem Hefe-2-Hybrid System als Bindungspartner von Rca1 identifiziert. Diese Interaktion konnte durch Koimmunopräzipitationsstudien bestätigt werden, welche zudem zeigten, dass die Bindung von SkpA auf der F-box in Rca1 beruht. Des Weiteren kopräzipitierte endogenes Cul1 mit Rca1 und auch dies erfolgte abhängig von der F-box. Diese Experimente zeigten, dass Rca1 einen Komplex mit den SCF Kernuntereinheiten SkpA und Cul1 bilden kann. Dieser SCF/Rca1 Komplex könnte den Eintritt in die S Phase beschleunigen, indem dieser Komplex den Abbau eines negativen Regulators des G1-S Übergangs vermittelt. Cyclin A/Cdk1 kann S Phasen induzieren, aber seine Aktivität ist in der Regel eingeschränkt durch den CKI Rux, inhibitorische Phosphorylierung durch Wee und APC/C-Cdh1Fzr abhängigen Abbau von Cyclin A. Die Koexpression von Rca1 beeinflusste die Proteinmengen dieser S Phase Inhibitoren nicht, so dass diese Proteine vermutlich keine Substrate des SCF/Rca1 Komplexes sind. Die Überexpression von Rca1 in larvalen Speicheldrüsen beeinträchtigt die Endoreplikation und führt zur Akkumulation von Cyclin A, Cyclin E und Cdk1. Expressionsprofile zeigten, dass mitotische Gene (z.B. Cyclin A/E, Cdk1) in Speicheldrüsen herunter reguliert sind, die Überexpression von Rca1 jedoch deren Transkription verstärkt. Zusätzlich zeigten die qRT-PCR Analysen erhöhte Transkriptlevel der E2F1 Zielgene Rnr2 und PCNA und vermuten, dass die Überexpression von Rca1 zu einer verstärkten E2F1 Aktivität führt. Da Cyclin E ebenfalls ein E2F1 Zielgen ist, lässt sich somit auch ein Anstieg der Cyclin E Transkripte erklären. Außerdem offenbarten die Genexpressionsanalysen, dass Komponenten des APC/C und dessen Substrat Geminin in Speicheldrüsen vorhanden sind und unterstützen somit die Annahme, dass Geminin und der APC/C-Cdh1Fzr Komplex zur Rereplikationskontrolle in endoreplizierenden Zellen beitragen.

German

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