Fluorescence Spectroscopy of Recoverin Function and Conformation

Hocht, Iris von der (2008). Fluorescence Spectroscopy of Recoverin Function and Conformation. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Recoverin is a neuronal calcium sensor protein (NCS protein) from the vertebrate photoreceptor which is involved in light adaptation. Recoverin changes its conformation upon sequential binding of two calcium ions. This conformational change induces the extrusion of a covalently attached myristoyl residue from a hydrophobic binding pocket which enables Recoverin to interact with lipid membranes (calcium myristoyl switch). In this thesis, I report on my investigation of Recoverin�s calcium myristoyl switch, using a recently developed modification of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) that is called dual focus FCS (2fFCS). This method allows for measuring absolute diffusion coefficients with an accuracy of better than a few percent. Recoverin, and the Recoverin mutants E85Q and E121Q which bind only one or no Ca2+, respectively, were labeled with the fluorescent dye Alexa647. Differences in the hydrodynamic radius due to conformational changes of Recoverin and its mutants upon calcium binding were monitored by measuring the diffusion coefficient of these molecules as a function of free calcium concentration. The calcium dependent interaction of Recoverin with lipid membranes was measured in solutions of small unilamellar vesicles (SUVs) of different lipid composition. Again, diffusion measurements were used to determine the fraction of free and lipid bound Recoverin using the strongly different diffusion coefficients of both fractions. To account for the fluorescence brightness difference of the dye label when in solution and close to a lipid membrane, a new three photon correlation analysis was developed and tested.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Fluoreszenzspektroskopie der Funktion und Konformation von Recoverin	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Recoverin ist ein neuronales Kalzium Sensor Protein (NCS-Protein) aus dem Photorezeptor der Wirbeltiere, das an der Lichtadaptation beteiligt ist. Recoverin ändert seine Konformation durch die sequenzielle Bindung von zwei Kalzium Ionen. Diese Konformationsänderung induziert die Freisetzung eines kovalent gebundenen Myristoylrestes aus einer hydrophoben Tasche des Proteins und erlaubt Recoverin, an Lipidmembranen zu binden (Kalzium Myristoyl Switch). In dieser Arbeit beschreibe ich die Untersuchung des Kalzium Myristoyl Switches von Recoverin mit einer vor kurzem entwickelten Modifikation der Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS), der Zwei Fokus FCS (2fFCS). Mit dieser Methode können absolute Diffusionskoeffizienten mit höchster Genauigkeit gemessen werden. Recoverin und die beiden Recoverin Mutanten E85Q und E121Q, die nur ein bzw. kein Kalzium Ion binden können, wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa647 markiert. Änderungen des hydrodynamischen Radius von Recoverin, die durch kalziuminduzierte Konformationsänderungen verursacht werden, können durch die Messung des Diffusionskoeffizienten als Funktion der Kalziumkonzentration beobachtet werden. Die kalziumabhängige Wechselwirkung von Recoverin und Lipidmembranen wurde mit Suspensionen kleiner, unilamellarer Vesikel (SUV) unterschiedlicher Zusammensetzung untersucht. Auch hier wurde das Diffusionsverhalten gemessen. Die sehr unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten der beiden Fraktionen wurden benutzt, um den Anteil von freiem und lipidgebundenem Recoverin zu bestimmen. Eine neue Drei Photonen Korrelationsanalyse, mit der die unterschiedlichen Fluoreszenzhelligkeiten der Farbstoffmarkierung in Lösung und nahe der Membran berücksichtigt werden können, wurde entwickelt und getestet.

German

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