Molekularbiologische, zellbiologische und funktionelle Analyse der L-Glutamat-Neurotransmitter Transporter des Zentralnervensystems

Kiss, Christine (2008). Molekularbiologische, zellbiologische und funktionelle Analyse der L-Glutamat-Neurotransmitter Transporter des Zentralnervensystems. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

In dieser Arbeit sollte zum, Studium der normalen und pathophysiologischen Bedeutung des GLT-1 Transporters ein Astrozyten-spezifisch und entwicklungsabhängig induzierbares konditionelle glt-1 null Mausmodell erstellt und analysiert werden. Zur Herstellung dieses Mausmodells für die konditionelle Gen-Ausschaltung des Glutamattransporters GLT-1 wurden zwei unterschiedliche replacement Vektoren GLTBS und GLT-RF konstruiert. Mit dem Nachweis der korrekten genomischen DNA Sequenz des gesamten GLT-RF targeting Konstruktes, der Isolierung homolog rekombinierter ES-Zell Klone, Überprüfung der Pluripotenz und des Karyotyps wurden die Rahmenbedingungen für die Generierung einer konditionellen GLT-1 Maus geschaffen. Durch Vorkern-Mikroinjektion wurde bisher eine Cre-Rekombinase exprimierende transgene Mauslinie generiert, die auf der Basis des TetOn Systems unter dem Astrozyten spezifischen Promoter gfap die Cre�Rekombinase Doxycyclin induzierbar exprimiert. Die funktionelle Analyse dieser transgenen Mauslinie zeigte keine Aktivierbarkeit. In glialen Zellkulturstudien hingegen wurde eine präzise Induktion der Cre-Rekombinase erzielt. Auf einem ähnlichen Konstrukt mit der Doxyzyklin induzierbaren Cre-Rekombinase, in dem gfap durch den myelinspezifischen mbp Promoter ersetzt wurde, zeigten im Tiermodell nach oraler Doxyzyclin Applikation eine präzise ausgelöste Induktion. In weiteren Studien zur Bedeutung der beiden anderen hauptsächlichen Glutamat Transporter wurden frühere Beobachtungen an GLAST-1 defizienten und Maus- Doppelmutanten GLAST-1/EAAC1 durch den wichtigen Befund, dass überwiegend weibliche Doppelmutanten im Alter von einem Jahr epileptische Anfälle entwickeln. Analysen zur Beziehung Glutamat Transporter und Glutamat Rezeptor-Expression zeigten dass sechs Wochen alte GLAST-1 -/- und GLAST-1 -/- / EAAC1 -/- Mäuse eine gesteigerte Expression des ionotropen Kainatrezeptors aufweisen. Expressionsmuster der Glutamatrezeptoren und der Glutamattransporter in Abhängigkeit des Neurotransmitters Glutamat wurden ermittelt. Dabei wurde der regulatorischeEinfluss der glutamatergen Transmission auf die mRNA Transkription aufgezeigt.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Glutamate transporters of the CNS (EAAT) form a family of plasma membrane residing transmembrane proteins, which regulate as high affinity Na+-dependent transporters in the synaptic cleft signal transduction and protect against excitotoxic neuronal damage. Immunohistochemical topology studies using GLT-1 and GFAP antibodies revealed that GLT-1 in predominantly expressed in astroglia. In this thesis an astrocyte � and a development specific conditional glt-1 null mouse mutant model should be generated, which would unveil the normal and pathophysiological function of GLT-1. For the conditional knock out of glt-1 two different replacement vectors were constructed GLT-BS and GLT-RF targeting constructs. The correct genomic structure of the mutated gene locus harbouring the GLT-RF targeting sequence was established, homologously recombined ES-cell clones isolated and their pluripotency and correct karyotype estabilshed. Blastocyst injection for the generation of the mouse mutant are under way. A transgenic mouse line bearing the cre-recombinase gene, which is inducible on the basis of the TetOn system under the astrocyte specific gfap promoter was generated by pronuclear microinjection. Expression studies on the induction of the cre-recombinase transgene by doxycyline in these transgenic lines show no activation so far. However, a precise induction of the cre-recombinase was achieved in glial cell culture. A similar construct, in which the gfap promotor was replaced by the myelin specific mbp promoter, resulted in a transgenic mouse line which allowed a successful cre-recombinase induction. In an extension of previous studies on the neurophsiological and neuropathological role of the two other dominant glutamate neurotransmitter transporters GLAST-1 and the double mutant GLAST-1/EAAC1 earlier observations were expanded by the important finding, that predominantly female double mutants at one year of age developed epileptic seizures and the �cycling syndrome�. Analyses, correlating glutamate transporter and glutamate receptor expression, were carried out in six week old GLAST-1 �/- and GLAST-1 -/- / EAAC1-/-mice. Upregulation of the expression of the ionotropic kainate receptor has been observed. The expression pattern of both the glutamate receptor families and of the glutamate transporters has been evaluated in dependence of the neurotransmitter glutamate concentration. A regulatory effect of glutamatergic transmission on the steady state level of glutamate transporter mRNA.

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