Universität zu Köln

Yazdanpanah, Benjamin (2008). Funktionelle Analyse der Riboflavinkinase und ihre Rolle in TNF induzierten Signalkaskaden. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Im Rahmen einer Suche nach neuen Adaptormolekülen von TNFR1 wurde die putative Riboflavinkinase (RFK) in unserem Labor als Interaktionspartner des Rezeptors identifiziert und kloniert. Obwohl die Kristallstruktur des Proteins publiziert und diese als RFK identifizierte wurde, fehlte bislang der biochemische Beweis für die Riboflavinkinaseaktivität. Basierend hierauf wurden im Rahmen dieser Arbeit sowohl RFK(wt), als auch zwei Punktmutanten - RFK(N36D) und RFK(E86Q) - als rekombinante GST-Fusionsproteine aufgereinigt und anschließend hinsichtlich ihrer Kinaseaktivität untersucht. Während RFK(wt) und RFK(N36D) eine vergleichbare Riboflavinkinaseaktivität aufwiesen, stellte sich RFK(E86Q) als loss of function Mutante heraus. Die Daten verdeutlichen, dass es sich bei diesem neuen TNFR1 assoziiertem Protein tatsächlich um die humane RFK handelt und dass der Aminosäure Glutamat-86 eine essentielle Rolle - vermutlich als katalytische Base - zugeschrieben werden kann. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass die Aktivität der RFK durch TNF Stimulation erhöht werden kann. Um die zelluläre Funktion der RFK untersuchen zu können, wurde zunächst eine Mauslinie mit konditional deletierbarem RFK-Allel konstruiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Inaktivierung der RFK zu einem frühen Zeitpunkt der Embryogenese zu embryonaler Letalität führt, was die essentielle Rolle der RFK für die Entwicklung des Organismus verdeutlicht. Parallel wurde mit Hilfe lentiviraler RNAi in HeLa Zellen gezeigt, dass 1) die RFK für TNF induzierte Apoptose, nicht aber für NF-κB Aktivierung in HeLa Zellen benötigt wird, 2) dass die RFK für die Produktion von ROS nach TNF Stimulation in HeLa Zellen und murinen Makrophagen essentiell ist und 3) dass die RFK als ein neuer Regulator der Caveolae/Lipid-Rafts vermittelten Endozytose an der antiviralen Abwehr der Zelle beteiligt ist. Die Kinaseaktivität der RFK scheint für all diese Effekte von Bedeutung zu sein, da nur die Transfektion von HeLa-shRFK Zellen mit RFK(wt), nicht aber mit der kinasedefizienten Mutante RFK(E86Q) zu Rekonstitution dieser Signalkaskaden führte. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die RFK neben normalen zellulären Aufgaben auch an TNF induzierten Signalkaskaden in Form von Regulation der ROS Produktion sowie Apoptose beteiligt ist.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Functional Analysis of Riboflavin Kinase and its Role in TNF Signaling English
Translated abstract:	Abstract Language Previous studies in our lab identified the putative riboflavin kinase (RFK) as a TNFR1 associated factor. Until recently, little is known about the biochemical and cellular function of this protein, although the published crystal structure led to the assumption, that it is the riboflavin kinase. For the purpose of understanding the nature of this novel TNFR1 adaptor molecule, we have first purified recombinant RFK(wt) and two point mutants RFK(N36D) and RFK(E86Q) and subjected them to riboflavin kinase assays. We found, that RFK(E86Q) turned out to be a loss of function mutant, while RFK(N36D) and RFK(wt) pocessed comparable enzymatic activities. Based on our findings we pinpoint glutamate-86 as the catalytic base involved in the phosphorylation of riboflavin to FMN. Furthermore, we could show an increased activity of RFK upon stimulation by TNF in vitro. To further identify the role of RFK, we decided to generate a conditional targeting allele of the murine RFK. Inactivation of the gene led to embryonal lethality and underlined its essential function during the development of the organism. In parallel, we generated cell-lines by means of lentiviral RNAi and could show that i) RFK is indispensible for TNF induced apoptosis but not NF-κB activation in HeLa cells, ii) RFK is essential for TNF induced ROS production in HeLa cells and murine macrophages and iii) RFK exerts antiviral activities as a novel regulator of caveolae/lipid-rafts mediated endocytic pathway. We could reverse these effects by transfecting RFK(wt) but not the kinase-deficient RFK(E86Q), suggesting that the kinase activity is important for the ascribed functions. Taken together, our data reveal, that RFK is not only involved in the normal homeostasis of the organism, but also in cellular innate immunity and in TNF mediated signalling via the regulation of ROS production and apoptosis. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Yazdanpanah, Benjamin benjamin.yazdanpanah@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-24989
Date:	2008
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language TNF, Riboflavin Kinase, ROS, Apoptose, Endozytose German TNF, Riboflavin Kinase, ROS, Apoptosis, Endocytosis English
Date of oral exam:	24 June 2008
Referee:	Name Academic Title Brüning, Jens Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2498