Der Regulationsmechanismus des Osmosensors BetP aus Corynebacterium glutamicum

Ott, Vera Magdalena (2008). Der Regulationsmechanismus des Osmosensors BetP aus Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Der sekundäre Glycinbetaintransporter BetP ist eines von vier osmoregulierten Transportsystemen, die in dem Gram-positiven Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum den Import von kompatiblen Soluten unter hyperosmotischen Bedingungen vermitteln. Hierbei fungiert BetP zugleich als Osmosensor und Osmoregulator. Das heißt, BetP ist in der Lage, osmotischen Stress selbstständig zu detektieren und seine katalytische Aktivität in Abhängigkeit des detektierten Stresses zu regulieren. Messungen in Proteoliposomen hatten belegt, dass eine erhöhte interne Kaliumionenkonzentration als spezifischer Reiz zur Aktivierung von BetP fungiert. In dieser Arbeit wurde erstmalig ein in vitro identifizierter Stimulus für einen Osmosensor in vivo verifiziert. So konnte gezeigt werden, dass die BetP-Aktivierung auch in lebenden Zellen von Kalium abhängt. Jedoch wurden Indizien gefunden, dass in vivo neben Kalium noch ein zweiter Stimulus zur osmoabhängigen BetP-Aktivierung existiert. Es war bekannt, dass die cytoplasmatische C-terminale Extension des BetP-Proteins in die K+-abhängige Regulation des Transporters involviert ist. Durch ortsgerichtete Mutagenese innerhalb dieser putativen, alpha-helikalen Sensordomäne wurde gezeigt, dass nicht einzelne Aminosäurereste, sondern vielmehr die korrekte Konformation oder relative räumliche Orientierung der C-terminalen Domäne für die BetP-Regulation entscheidend ist. Die Charakterisierung C-terminaler BetP-Varianten in verschiedenen Membranumgebungen ließ den Schluss zu, dass die Konformation der alpha-helikalen C-Domäne über Interaktionen mit negativ geladenen Membranlipiden stabilisiert wird. Diese These konnte gestützt werden, indem Interaktionen der C-Domäne mit verschiedenen Lipidoberflächen durch Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie analysiert wurden. Außerdem wurden mittels biochemischer Methoden erstmalig weitere cytoplasmatische Proteinbereiche identifiziert, die über Interaktionen mit der C-Domäne zur Detektion oder Transduktion des Kaliumsignals in den Mechanismus der BetP-Aktivierung eingebunden sind. Durch die hier gewonnenen Daten konnte ein neues Modell für den Regulationsmechanismus des Osmosensors BetP entworfen werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
The regulatory mechanism of the osmosensor BetP from Corynebacterium glutamicum	English

Translated abstract:

Abstract

Language

The secondary glycine-betaine transporter BetP is one of four osmoregulated carriers, which mediate the import of compatible solutes in the Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum under hyperosmotic conditions. BetP serves both as an osmosensor and osmoregulator. Thus the protein has the ability to sense osmotic stress and to regulate its catalytic activity in dependence of the given stress situation. Investigations in proteoliposomes had shown that an elevated internal K+ concentration is the specific stimulus for BetP activation in vitro. In this work a stimulus for an osmosensor identified in vitro could be verified in vivo for the first time, as it was shown that BetP activity depends also in living cell on the presence of potassium. However, the in vivo measurements indicated that beyond K+ a second stimulus is required for osmoresponsive BetP-activation in living cells. It was known that the cytoplasmic C-terminal BetP-domain is essential for potassium sensing. Using site-directed mutagenesis here it was proven that rather the correct conformation or relative spatial orientation than single amino acid residues of this alpha-helical domain is critical for BetP-regulation. The characterization of C-terminal mutants in diffent membrane surroundings revealed that the conformation of the C-domain is stabilized by interactions with negatively charged membrane lipids. This idea was corroborated by investigating C-domain interactions with lipids of various compositions in surface-plasmon-resonance spectroscopic studies. By using biochemical methods distinct cytoplasmic protein regions could be identified as interaction partners of the C-domain. These are most likely involved in the detection or transduction of the stimulating K+-signal. The data provided by this work are combined in a new model describing the BetP regulatory mechanism.

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