Universität zu Köln

Hardt, Olaf Thorsten (2008). Molecular characterization of CNS interneurons: subtype diversity and fate determinants. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

In this project two approaches have been used to gain insights into the identity and molecular regulation of interneurons in the brain. First, a general molecular characterization of GABAergic neuron subtypes has been performed and second, novel fate determinants specifically for olfactory bulb interneurons have been identified and investigated in detail. GABAergic neurons, the largest population of inhibitory neurons in the brain, play crucial roles in information processing. While most of these neurons are interneurons, some, for example in the striatum, represent projection neurons. So far, biochemical, morphological, and electrophysiological properties served as exclusive criteria for the classification of GABAergic neurons. Although these parameters allow for a partial description of subpopulations, a systematic dichotomy is not available. Therefore, the general molecular characteristics of GABAergic neurons were analyzed and differences among distinct brain regions were defined. Transgenic GAD67-GFP mice in concert with flow cytometric cell sorting were used to isolate GABAergic neurons from defined regions of the postnatal mouse brain, namely olfactory bulb, cortex, striatum and cerebellum. Subsequently, gene expression profiling as well as cell surface proteome analysis were carried out and identified genes were validated by in situ hybridization and qPCR. Potential new marker genes for GABAergic neurons and candidate factors necessary for their differentiation and general functionality were determined. Clustering of gene expression data revealed major differences between hind- and forebrain GABAergic neurons indicating a correlation between their development and localization. For example, while GABAergic neurons of the forebrain are characterized mainly by three groups of transcription factors, namely the Distal-less-family, the POU-family and the ETS/FOX-family; specific members of the ZIC- and LHX-family define hindbrain inhibitory neurons. Olfactory bulb interneurons are generated throughout live by adult neuronal stem cells localized in the subventricular zone. While considerable information is available concerning the generation and migration of these cells, the molecular mechanisms regulating their terminal differentiation are barely understood. Therefore, mature interneurons from the periglomerular layer and their specific precursors were isolated by microdissection and magnetic cell sorting. Gene expression analysis was performed by microarray analysis. Several candidate factors to be involved in the differentiation of olfactory bulb interneurons were identified. The bHLH transcription factors NeuroD1 and NeuroD2 were analyzed for their functional relevance in vivo. Using in vivo electroporation, overexpression of these transcription factors was induced in postnatal forebrain stem cell populations as well as their progeny, namely neuronal precursors and mature neurons of the olfactory system. It was shown that high expression of NeuroD2 delayed the differentiation of Type A neuronal precursor cells into granule- and periglomerular neurons. In contrast, overexpression of NeuroD1 induced the premature and ectopic differentiation of precursor cells. Furthermore, NeuroD1 induced specifically a dopaminergic phenotype, indicating that it represents a novel key fate determinant for the specification of periglomerular interneurons, possibly with a GABA/dopamine bifunctional neurotransmitter phenotype. In conclusion, this study represents a comprehensive molecular basis for the understanding of spatially as well as temporally defined GABAergic neuron subpopulations and led to the identification of novel fate determinants for the differentiation of inhibitory interneuron subpopulations.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Molekulare Charakterisierung GABAerger Interneurone: Diversität und Determination German
Translated abstract:	Abstract Language Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Ansätze genutzt, um neue Einblicke bezüglich der Identität und molekularen Regulation inhibitorischer Interneurone im Gehirn zu erlangen. Zum einen wurde eine generelle molekulare Charakterisierung GABAerger Interneuron-Subpopulationen durchgeführt, zum anderen wurden neue Regulatoren der Bulbus Olfaktorius Interneuron-Differenzierung identifiziert und funktionell analysiert. GABAerge Neurone, die häufigsten inhibitorischen Nervenzellen im Gehirn, sind essentiell für die korrekte Informationsverarbeitung im zentralen Nervensystem. Während die große Mehrheit dieser Zellen lokal projizierende Interneurone sind, findet man in einigen Arealen wie dem Striatum auch GABAerge Projektionsneurone. Bisher wurden GABAerge Neurone anhand einiger biochemischer, morphologischer und elektrophysiologischer Eigenschaften charakterisiert. Da aber keine strikte Korrelation zwischen diesen Faktoren existiert, gelang es bisher nicht, Subpopulationen GABAerger Zellen systematisch zu unterteilen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die generellen molekularen Eigenschaften GABAerger Neurone analysiert und Unterschiede zwischen verschiedenen Hirnarealen definiert. Dazu wurden fluoreszent markierte GABAerge Neurone aus transgenen GAD67-GFP Mäusen mit Hilfe der FACS Technologie aus dem gesamten Hirn sowie den definierten Arealen Bulbus Olfaktorius, Cortex, Striatum und Cerebellum isoliert. Anschließend wurden Proteom- sowie Genexpressions-Analysen durchgeführt, die mit Hilfe von in situ Hybridisierungen und qPCRs validiert wurden. Neue intrazelluläre und Zelloberflächen-Marker sowie Gene, die vermutlich wichtig für die Entwicklung und Funktionalität GABAerger Neurone sind, wurden identifiziert. Korrelations- und Clusteranalysen zeigten insbesondere Unterschiede zwischen Zellen des Vorder- und Hinterhirns auf. Während GABAerge Neurone des Vorderhirns hauptsächlich durch drei Familien von Transkriptionsfaktoren, der Distal-less-Familie, der POU-Familie und der ETS/FOX-Familie, charakterisiert waren, definierten spezifische Transkriptionsfaktoren der ZIC- und LHX-Familien inhibitorische Hinterhirn-Neurone. Interneurone des Bulbus Olfaktorius werden zeitlebens durch adulte neuronale Stammzellen in der Subventrikulär-Zone generiert. Die molekularen Mechanismen der terminalen Differenzierung dieser Zellen sind bisher allerdings nur ansatzweise verstanden. Definierte Differenzierungsstadien dieser Interneurone sowie ihrer Vorläuferzellen wurden mit Hilfe magnetischer Zellisolierung nach Mikrodissektion von periglomerulärem beziehungsweise subventrikulärem Gewebe isoliert. Durch Genexpressions-Analysen wurde eine Reihe von Kandidaten identifiziert, die vermutlich an der Differenzierung olfaktorischer Interneurone beteiligt sind. Zwei dieser Gene, NeuroD1 und NeuroD2, wurden auf ihre funktionelle Relevanz in vivo hin untersucht. Mit Hilfe der in vivo Elektroporation wurde die Überexpression dieser Transkriptionsfaktoren in Stamm-, Vorläufer- sowie ausdifferenzierten Zellen induziert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die starke Expression von NeuroD2 eine verzögerte Differenzierung GABAerger Interneurone des Bulbus Olfaktorius bewirkt. Im Gegensatz dazu war die Überexpression von NeuroD1 ausreichend, um eine vorzeitige und ektopische Differenzierung von Vorläuferzellen entlang ihrer tangentialen Migrationsroute sowie im Striatum auszulösen. Diese Überexpression führte weiterhin hochspezifisch zur Ausbildung eines Dopaminergen Neurotransmitter-Phänotyps, woraus eine zentrale Rolle von NeuroD1 für die Spezifizierung bifunktionaler GABA/Dopamin-positiver Interneurone hervorgeht. Im Rahmen dieser Studie wurde eine umfassende molekulare Basis für das Verständnis räumlich und zeitlich definierter GABAerger Neurone bereitgestellt. Weiterhin wurden Gene identifiziert, die zentrale Funktionen während der Differenzierung inhibitorischer Interneuron-Subpopulationen übernehmen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hardt, Olaf Thorsten olaf@miltenyibiotec.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-25059
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language GABA, Interneuron, Determination, Transkriptionsfaktor, MACS German GABA, Interneuron, Determination, Transcriptionfactor, MACS English
Date of oral exam:	13 October 2008
Referee:	Name Academic Title Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2505