Universität zu Köln

Pongratz, Carola (2008). Potente HIV-gerichtete RNA-Interferenz mittels Selektion einer randomisierten lentiviralen shRNA-Bibliothek. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Um neue potente shRNA-Sequenzen gegen HIV-1 zu identifizieren, wurde zum ersten Mal eine randomisierte lentivirale shRNA-Bibliothek konstruiert. Die Expression der shRNAs wurde dabei von einem RNA Polymerase III Promoter (Pol III) gesteuert. Die Selektion potenter shRNA-Sequenzen erfolgte über zu diesem Zweck etablierten Zelllinien. Sowohl die Konstruktion als auch das Selektionssystem basierten auf etablierten Technologien, die jedoch in einigen Punkten zwecks erhöhter Diversität der Bibiothek und optimierter Selektionsbedingungen modifiziert wurden. Die Validierung der selektierten shRNA-Sequenzen zeigte, dass mehr als die Hälfte der shRNAs ein inhibitorisches Potential von über 70% aufwiesen. Sequenzanalysen subklonierter shRNA-Expressionskassetten demonstrierten ihre HIV-1 Spezifität. Außerdem zeigten Vergleichsanalysen mit öffentlichen siRNA-Algorithmen, dass die meisten der hier selektierten shRNAs die Parameter der Algorithmen nicht erfüllen konnten. Daraus resultiert, dass die selektierten shRNA-Sequenzen zusammen mit anderen selektierten Bibliotheken einen wichtigen Beitrag zur Verbesserung der entscheidenden Parameter der siRNA-Algorithmen leisten könnten, weil sie aufgrund ihrer Effizienz und möglicher Toxizität und nicht ihrer Sequenz selektiert wurden. Um die Konvertibilität der inhibitorischen Sequenzen zu überprüfen, wurde das Pol III System mit synthetischen siRNAs und RNA Polymerase II gesteuerten miRNAs verglichen. Dabei stellte sich das Pol III System als das effizienteste heraus. Synthetische siRNA-Derivate ausgewählter hochpotenter shRNA-Sequenzen wiesen zwar ein vergleichbar starkes inhibitorisches Potential auf, die transiente Wirkdauer und die geringe Stabilität einiger siRNA-Sequenzen in Serum limitiert jedoch ihren Einsatz in klinischen Studien. Die Expression der shRNAs in einer miRNA-Umgebung offenbarte wiederum nur eine geringe inhibitorische Wirkung und erfordert weitere Optimierungen dieses Expressionssystems. Die stabile lentivirale Expression von shRNAs in HIV permissiven HeLa-P4-Zellen zeigte eine effiziente Inhibition der Virusreplikation nach Infektion mit HIV-1. Da die inserierten shRNAs in Zelllinien selektiert und reevaluiert wurden, kann außerdem von einer geringen Zytotoxizität ausgegangen werden. Dies macht sie für einen etwaigen Einsatz in gentherapeutischen Ansätzen interessant.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language To identify novel potent shRNA-sequences against HIV-1 a randomized lentiviral RNA Polymerase III promoter (Pol III) driven shRNA-library has been engineered. The selection of potent shRNA-sequences was perfomed in HIV-1 specific stable celllines. Both the construction of the shRNA-library and the selection system are based on established technologies but were modified to increase the diversity of the shRNA-library as well as to optimize the selection conditions. The validation of the selected shRNA-sequences revealed that more than 50% of the shRNAs exhibited an inhibitory potential of over 70%. Sequence analysis of subcloned shRNA-expression cassettes demonstrated HIV-1 specificity. Furthermore, the analysis of public siRNA-algorithms showed that most of the experimentally selected shRNAs did not fit in the parameters of known algorithms. The evaluation of such siRNA libraries could have a great impact on the optimization of the critical parameters of siRNA-algorithms, because they were selected due to their potency and possible toxicity and not to their sequence. In order to assess the convertibility of the inhibitory sequences, the pol III system was compared with synthetic siRNAs and Pol II expressed miRNAs. The Pol III system appeared to be the most efficient. Although, the majority of the corresponding synthetic siRNA sequences exhibited a comparable inhibitory potential, their use in clinical trials is limited due to their transient effect and their low stability in serum. The expression of selected shRNA sequences in a miRNA environment revealed a minor potency and the need for optimization of this system. The stable lentiviral expression of the pol III shRNAs in the permissive HeLa P4 cell line exhibited a significant inhibition of virus replication in an HIV-1 infection model. Additionally, these shRNA sequences seem to pocess only small if any toxicity based on their selection and reevaluation in cell lines, which may turn them into candidates for gene therapy studies. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Pongratz, Carola carolapongratz@gmx.net UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-25283
Date:	2008
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language HIV, RNAi, lentivirale shRNA-Bibliothek German HIV, RNAi, lentiviral shRNA library English
Date of oral exam:	22 October 2008
Referee:	Name Academic Title Brüning, Jens C. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2528