Universität zu Köln

Herz, Jasmin (2008). Acid Sphingomyelinase is a critical regulator in cytotoxic granule secretion of primary T lymphocytes. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The acid sphingomyelinase (ASMase) hydrolyses the membrane lipid sphingomyelin into ceramide and phosporylcholine. ASMase localises to phagosomes, endosomes, lysosomes and the plasma membrane, i.e. those subcellular sites which are at the crossroads of many immunological processes. One of these is granule-mediated cytotoxicity as the major effector mechanism of CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL). Cytotoxic granules have been characterized previously as secretory lysosomes. This raised the question, whether ASMase contributes to granule-mediated cytotoxicity of CD8+ T cells. In my diploma project, I have already shown that ASMase is required for the effective control of the acute infection with the Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) in mice. More specifically, ASMase-deficient (ASMase-/-) CTL were shown to be severely impaired in their virus-specific cytotoxicity. This project aimed at elucidating the ASMase-dependent mechanism contributing to effective cytotoxicity of CD8+ CTL. Analysis of ASMase-/- CD8+ T cells revealed that the transcription, translation, intracellular storage and processing of cytotoxic effector molecules proceed without defects. Moreover, in ASMase-/- CD8+ T cells no hints for the accumulation of sphingomyelin were detected. These findings excluded excessive sphingomyelin as the cause for impaired cytotoxicity. The specificity of the ASMase-dependent mechanism was shown by a strongly reduced T cell receptor-triggered release of cytotoxic effector molecules while secretion of the chemokine RANTES was not impaired in ASMase-/- CTL. In ASMase-/- T cells, cytotoxic granules were shown to fuse properly with the plasma membrane at the immunological synapse. The very last step of granule exocytosis, i.e. the extrusion of granular contents, is impaired by deficiency in ASMase. Even in CTL unable to generate high molecular weight granule matrix, the secretion of low molecular weight granule contents was strongly impaired by ASMase-deficiency. Biomorphometry revealed that cytotoxic granules are of identical size in wt and ASMase-/- CTL prior to fusion with the plasma membrane. However, after fusion with the plasma membrane, in ASMase-/- CD8+ T cells the granules remain significantly larger than in wt cells. This phenomenon can be explained by the biophysical consequences of ASMase activity: Generation of ceramide in wt cells increases the surface tension within the inner leaflet of cytotoxic granules. According to Laplace�s law this facilitates the collapse of the fused granule, thus leading to effective extrusion of the granules contents.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Die Saure Sphingomyelinase reguliert die Sekretion von zytotoxischen Granula bei T-Lymphozyten German
Translated abstract:	Abstract Language Die saure Sphingomyelinase (ASMase) hydrolisiert das Membranlipid Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin. ASMase ist in Phagosomen, Endosomen, Lysosomen und an der Plasmamembran lokalisiert, d.h. an den subzellulären Orten, die Schnittstelle vieler immunologischer Prozesse sind. Einer hiervon ist die Granula-vermittelte zytotoxische Aktivität als wichtigster zytotoxischer Effektormechanismus von CD8+ zytotoxischen T Lymphozyten (CTL). Zytotoxische Granula wurden bereits als sekretorische Lysomen charakterisiert. Daraus entstand die Frage, ob die ASMase an der Granula-vermittelten Zytotoxizität von CD8+ T Zellen mitwirkt. In meiner Diplomarbeit habe ich bereits gezeigt, dass die ASMase für die effektive Elimination des Virus der Lymphozytären Choriomeningitis (LCMV) aus akut infizierten Mäusen notwendig ist. ASMase-defiziente CTL sind in ihrer virus-spezifischen Zytotoxizität stark beeinträchtigt. Ziel dieser Arbeit ist die Aufklärung der ASMase-abhängigen Mechanismen, die zu einer effektiven Zytotoxizität von CD8+ T Zellen beitragen. Die Spezifität des ASMase-abhängigen Mechanismus wurde nachgewiesen durch eine stark reduzierte Ausschüttung der zytotoxischen Effektormoleküle nach Stimulation des T-Zell Rezeptors, wohingegen die Sekretion von RANTES nicht beeinträchtigt war. Die Analyse von ASMase-/- CTL zeigte, dass die Transkription, Translation, intrazelluläre Speicherung und Prozessierung der zytotoxischen Effektormoleküle ungestört ist. Außerdem wurden in ASMase-/- CTL keine Hinweise auf die Akkumulation von Sphingomyelin gefunden. Diese Daten schließen die übermäßige Speicherung von Sphingomyelin als Ursache für die beeinträchtigte Zytotoxizität aus. Überraschenderweise fusionieren in ASMase-/- CTL die zytotoxischen Granula unbeeinträchtigt mit der Plasmamembran. Allerdings ist der letzte Schritt der Exozytose zytotoxischer Granula, die Extrusion des Granulainhalts, in ASMase-/- T-Zellen gestört. Sogar in CTL, die keine hochmolekulare Granulamatrix synthetisieren können, war die Sekretion von niedermolekularem Granulainhalt durch den Defekt der ASMase stark gestört. Biomorphometrische Messungen zeigten, dass zytotoxische Granula vor der Fusion mit der Plasmamembran in ASMase-/- CTL genauso groß sind wie in wt CTL. Allerdings bleiben die Granula nach der Fusion mit der Plasmamembran in ASMase-/- T-Zellen signifikant größer als in wt Zellen. Dieses Phänomen kann über die biophysikalischen Eigenschaften der ASMase Aktivität erklärt werden: die Bildung von Ceramid in wt CD8+ T-Zellen erhöht die Oberflächenspannung der inneren Membrane des zytotoxischen Granulum. In Übereinstimmung mit Laplace´s Gesetz, ermöglicht dies den Kollaps des fusionierten Granulums, was zu einer effektiven Ausschüttung des Granulainhalts führt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Herz, Jasmin jasmin.herz@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-25734
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene > Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language zytotoxische Granula, zytotoxische T Lymphozyten, Sphingomyelinase German cytotoxic granules, secretory lysosomes, cytotoxic T lymphocytes, sphingomyelinase, ceramide English
Date of oral exam:	30 June 2008
Referee:	Name Academic Title Krönke, Martin Prof. Dr. med
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2573