EPR-based structural and functional characterization of the C-terminal domain of the osmoregulated glycine betaine transporter BetP from Corynebacterium glutamicum

Nicklisch, Sascha Carsten Thomas (2008). EPR-based structural and functional characterization of the C-terminal domain of the osmoregulated glycine betaine transporter BetP from Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Als Gram-positives Bodenbakterium ist Corynebacterium glutamicum regelmäßig diversen Stresssituationen ausgesetzt, die das Überleben der Zelle beeinträchtigen können. Neben wechselnden pH- und Temperatur-Werten, werden die Zellen auch mit Osmolaritätschwankungen des umgebenden Mediums konfrontiert. Es konnte gezeigt werden, dass das sekundäre Glycinbetain Aufnahmesystem BetP aus diesem Bakterium in der Lage ist, den unter hyperosmotischen Bedingungen intrazellulär erhöhten Kaliumgehalt als spezifischen Stimulus autonom zu detektieren (Osmo-/Chemosensor) und seine Aktivität daraufhin an das Ausmaß des Stresses anzupassen (Osmoregulator). Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass Änderungen in der Struktur und/oder der relativen Orientierung der C-terminalen Domäne des carrier einen starken Einfluss auf die Stimulusdetektion und/oder die nachgeschaltete Signaltransduktion haben. Da die molekularen Mechanismen solcher sensorischen Eigenschaften von Transportproteinen bislang nur unzureichend untersucht und verstanden sind, wurde in der vorliegenden Arbeit eine Kombination aus ortspezifischer Spinmarkierung (site-directed spin labelling, SDSL) und Elektronenspinresonanzspektroskopie (ESR) angewendet, um die molekulare Dynamik während des Aktivierungsprozesses von BetP zu untersuchen. Im Fokus lagen dabei zum einen die tertiäre Struktur des Transporters als auch die Aufklärung von strukturellen Änderungen der C-Domäne sowie deren mögliche Interaktion mit angrenzenden Protein- und/oder Lipid-Bereichen im aktivierten Protein. Strategisch eingeführte Cystein-Reste zu Beginn (545), in der Mitte (572) und nahe dem Ende (589) der C-Domäne wurden auf ihre jeweilige Aktivitätsregulation hin überprüft. Darüber hinaus wurden die Markierungs- und Rekonstitutionsschritte für jede Mutante optimiert, um eine hohe Ausbeute an spinmarkiertem, gereinigtem Material für die EPR-basierten Analysen zu erhalten. Es konnte eine hochgradige Absorption von BetP durch den direkten Kontakt zu den Bio-Beads (bis zu 90%) während des herkömmlichen Rekonstitutions-Assay identifiziert werden. Daraufhin wurde eine neue Rekonstitutionsmethode für den verlustfreien Einbau von spinmarkiertem BetP Protein in E. coli-Liposomen etabliert, deren Effizienz um etwa 60% höher lag als mit der herkömmlichen Methode. Die SDSL-ESR-Studien zeigten zum einen, dass der Einbau von solubilisiertem BetP in E. coli-Liposomen einen ausgeprägten Einfluss auf die Konformation und/oder räumliche Orientierung der C-Domäne hat. Eine hyperosmotisch induzierte Aktivierung des Transportproteins zeigte zudem eine erhöhte spinlabel-Mobilität am Ende der C-Domäne auf, die auf strukturelle Änderungen während des Aktivierungsprozesses hinwies. Das Ausmaß der Mobilisierung war dabei maßgeblich von der Art (Ionenstärke, Osmolalität) des benutzten Osmolytes abhängig. Die vorläufigen Ergebnisse der Abstandsmessungen von Einzel- und Doppelcystein-Mutanten bestätigten einen oligomeren Zustand (z.B. Trimer) von solubilisiertem und in E. coli-Liposomen eigebautem BetP. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der zusätzliche Einbau eines Prolins in einer deregulierten Dreifachmutante BetP-S545C/Y550P/S589C einen Einfluss auf die Struktur der C-terminalen Domäne im nicht aktiven Zustand des Proteins hat. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten konnten in einem aktuellen Topologie-Modell kombiniert werden, das die möglichen Konformationen und die Dynamik der C-terminalen Domäne während des Aktivierungsprozesses von BetP zusammenfasst.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
EPR-basierte strukturelle und funktionelle Analyse der C-terminalen Domäne des osmoregulierten Glycinbetain-Transporters BetP aus Corynebacterium glutamicum	German

Translated abstract:

Abstract

Language

As a Gram-positive soil bacterium, Corynebacterium glutamicum regularly encounters various kinds of stresses that threaten the cell's survival. Beside an alternating pH and temperature, the cells are faced with changes in the osmolarity of the external medium. Recently, it was shown that the secondary glycine betaine uptake system BetP of this bacterium is able to autonomously sense a hyperosmotic stress induced cytoplasmic accumulation of potassium as specific stimulus (osmo-/chemosensor). Subsequently, the carrier is able to regulate its activity in response to the extent of the osmotic stress it is exposed to (osmoregulator). Further studies revealed that changes in the structure and/or orientation of the cytoplasmically exposed C-terminal domain of the carrier seem to be critically involved in stimulus sensing and/or signal transduction. Since the molecular mechanisms related to these processes are barely understood to date, in the present work Site-Directed Spin Labelling-Electron Paramagnetic Resonance (SDSL-EPR) spectroscopy was applied for the first time to probe the molecular dynamics during BetP function. Focus was on the structure and structural changes of the C-terminal domain or adjacent protein and/or lipid domains. Strategically engineered BetP mutants with single cysteine substitutions at the beginning (545), in the centre (572) and close to the end (589) of the C-terminal domain were tested for sustained transport activity as well as for optimal labelling and reconstitution into E. coli lipids to obtain enough highly purified material for EPR analysis. Absorption of about 90% of spin labelled BetP by Bio-Beads was observed when the standard reconstitution procedure was used. We concluded that at least the C-domain is apparently involved in this process. A new procedure for the reconstitution of the carrier into E. coli liposomes was established with about 6-7times higher protein recovery compared to the standard Bio-Bead method. SDSL-EPR revealed that the structure/conformation of the whole C-terminal domain seem to be influenced by the incorporation into E. coli lipids. The activation of BetP mutants by hyperosmotic stress showed at least at the terminal part of the C-domain a certain mobility effect, indicative of a structural/conformational change. However, the extent of this mobility effect was strongly dependent on the nature (osmotic and/or ionic strength) of the used osmolyte. The preliminary distance measurements of single and double spin labelled BetP variants confirmed an oligomeric state (e.g. trimer) of BetP in detergent as well as reconstituted into liposomes. In addition, a slight effect of a proline substitution in a deregulated triple mutant (BetP-S545C/Y550P/S589C) on the structure of the C-terminal domain was observed. The data provided in this work are combined in a current model outlining possible C-terminal structures and dynamic motions upon BetP activation.

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