Universität zu Köln

Seeger, Jens Michael (2009). SMAC dependency of XIAP mediated chemoresistance. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

An important hallmark of tumor cells is their resistance to apoptosis. Apoptosis is a tightly regulated cellular response that ultimately results in the elimination and disposal of unwanted or damaged cells. Apoptosis is brought about by a family of proteases known as the caspases, the activity of which is responsible for the organized destruction of the cell. Each step of the apoptotic signaling cascade is under stringent control. Apoptotic signaling can be regulated at the apical point of the apoptotic cascade by controlling the translation of death-inducing signals into proteolytic activity or more critically by direct modulation of proteolytic activity of caspases. The later is modulated by direct interaction of caspases with members of the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family, the most studied one, X-linked IAP (XIAP), has evolved to potently inhibit the enzymatic activity of mammalian caspases. By efficiently inhibiting caspases XIAP has been shown to block apoptosis and described as a factor conferring resistance against different chemotherapeutic drugs (chemoresistant factor) in a variety of tumor cells. Furthermore, elevated XIAP expression has been frequently observed in several tumor tissues and XIAP targeting sensitizes diverse tumor cell lines for chemotherapeutic agents underlining the role of XIAP in tumor chemoresistance. However, by generating stable cell lines overexpressing XIAP the data provided show that XIAP overexpression alone does not generate a chemoresistant phenotype. Experiments evaluating both XIAP overexpression and stable knock-down of SMAC, a critical regulator of XIAP, show that XIAP action as a chemoresistant factor is tightly controlled by SMAC. In contrast to Bcl2 that acts as a mitochondrial gatekeeper, XIAP does not alter mitochondrial functions. Cytostatic drugs readily induce release of SMAC in cells with functionally intact mitochondria independent of caspase action, thereby completely neutralizing the anti-apoptotic action of even overexpressed XIAP. Although increased cytotoxic activity by different cytostatic drugs was observed, XIAP targeting failed to restore chemosensitivity in chemoresistant Hodgkin Lymphoma-derived cell lines indicating limited involvement of XIAP in chemoresistance. Unlike chemotherapeutic agents, XIAP targeting resulted in complete reactivation of the apoptotic machinery in response to grzB treatment regardless of mitochondrial functional state. These data demonstrated for the first time that it is essential to assess the mitochondrial capacity to release SMAC as well as the expression levels of both XIAP and SMAC in order to predict the chemosensitivity of particular tumours, a relationship that has not previously been recognised.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language SMAC Abhängigkeit der XIAP vermittelten Chemoresistenz German
Translated abstract:	Abstract Language Ein wichtiges Merkmal von Krebszellen ist ihre Apoptoseresistenz, welche wesentlich zu der Resistenz gegenüber dem Immunsystem und der Chemotherapie beiträgt. Bei der Apoptose handelt es sich um eine streng regulierte zelluläre Reaktion, deren charakteristische Merkmale unter anderem die Veränderungen der Plasmamembran (membrane blebbing) und die Kondensierung des Zellkernes beinhalten. Dabei ist die Aktivität einer Familie von Proteasen, der Caspasen, essentiell für die systematische Eliminierung der Zelle. Die Initiation der Apoptose erfolgt über die Signaltransduktion eines apoptotischen Stimulus zur proteolytischen Aktivierung der Initiatorcaspasen (Caspase-8 und -9), die ihrerseits die Effektorcaspasen (Caspase-3, -6 und -7) proteolytisch aktivieren. Die Aktivierung von Caspasen kann über mindestens zwei Apoptosesignalwege erfolgen: Der erste Signalweg wird durch die Aktivierung der Todesrezeptoren auf der Zelloberfläche durch die Bindung ihrer spezifischen Liganden eingeleitet, was zur Rekrutierung und Aktivierung von Caspase-8 führt. Die Aktivierung des zweiten Signalweges, dem mitochondrialen Apoptosesignalweg, führt zur Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran (MOMP) und dadurch zur Freisetzung von proapoptotischen Proteinen wie Cytochrome c aus dem Intermembranraum ins Zytosol. Zusammen mit den zytosolischen Komponenten Apaf-1 und Caspase-9 initiiert es die Formierung des Apoptosoms wodurch die Aktivierung von Caspase-9 erfolgt. Aufgrund der immensen Bedeutung der Apoptose wird jeder Schritt in der apoptotischen Signalkaskade strengstens kontrolliert. Die Funktion von Caspasen als Haupteffektoren der Apoptose kann mittels verschiedener (Adapter-) Proteine reguliert werden, die entweder direkt oder indirekt die Aktivierung und die Aktivität der Caspasen beeinflussen. Mitglieder der Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP) Familie können die Apoptose durch die direkte Interaktion mit den Caspasen regulieren. Das am besten erforschte Protein dieser Familie, das XIAP, ist in der Lage die enzymatische Aktivität von Caspasen effizient zu hemmen und gilt als der potenteste zelluläre Caspaseinhibitor. Weiterhin wird die Funktion von IAPs durch verschiedene zelluläre Proteine moduliert. Der wohl bekannteste zelluläre Inhibitor von den IAPs ist SMAC, welcher durch die Prozessierung in den Mitochondrien das NH2-terminale AVPI-Motiv präsentiert, das für die Bindung und die Inhibition von IAPs essentiell ist. Während der Apoptose wird neben Cytochrome c unter anderem auch das maturierte SMAC ins Zytosol freigesetzt, wo es dann die IAPs inhibieren kann. Durch die direkte Interaktion und effiziente Inhibition von Caspasen wurde XIAP als ein anti-apoptotisches Protein identifiziert. Weiterhin wurde eine erhöhte Expression von XIAP in verschiedenen Tumorzellen beobachtet, die mit einem geringen Therapieerfolg assoziiert war. Darüber hinaus führte die Verminderung der Expression von XIAP mittels RNAi oder die Blockade seiner inhibitorischen Funktion, z. B. durch SMAC, zu einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Chemotherapeutika in einer Vielzahl von Tumorzellen. Somit wurde XIAP in den vergangenen Jahren als ein viel versprechendes Therapieziel in malignen Erkrankungen identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von XIAP in der Chemoresistenz von Tumoren untersucht. Dabei wurden stabile Zelllinien mit Modifikation der Expression von XIAP und SMAC etabliert und mit verschiedenen Zytostatika behandelt. Im Gegensatz zum aktuellen Modell über die Rolle von XIAP bei der Resistenz gegenüber chemotherapeutischen Substanzen zeigen diese Daten, dass eine Überexpression von XIAP allein keine Chemoresistenz erzeugen kann. Alle hier getesteten konventionellen Zytostatika induzieren unabhängig von der Caspaseaktivität oder von XIAP die Freisetzung von SMAC aus den Mitochondrien und neutralisieren damit vollständig die antiapoptotische Wirkung von sogar überexpremiertem XIAP. Dahingegen führte ein stabiler knock-down von SMAC in der Kombination mit einer Überexpression von XIAP zu einer deutlichen Chemoresistenz, was folglich die Funktion von XIAP als Chemoresistenzfaktor in der Abhängigkeit der Expression und der mitochondrialen Freisetzung von SMAC stellt. Die Analyse der Chemosensitivität von malignen Hodgkin Lymphom Zelllinien zeigt, dass der knock-down von XIAP in diesen Zellen zwar zu einer erhöhten Chemosuszeptibilität führt aber nicht vollständig den Apoptosesignalweg reaktivieren kann. Diese Beobachtungen lassen auf eine eher geringfügige Bedeutung der erhöhten XIAP Expression für die Prognose über die Tumor-Chemosuszeptibilität schließen. Diese Daten zeigen zum ersten Mal, dass es unerlässlich ist die mitochondriale Fähigkeit zur Freisetzung SMAC sowie die Expressionslevel von XIAP und SMAC zu berücksichtigen, um eine Vorhersage über die Chemosensitivität von Tumoren zu treffen - eine Beziehung zueinander, die bisher nicht anerkannt wurde. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Seeger, Jens Michael aei70@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26315
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Apoptose, Chemoresistenz German apoptosis, chemoresistance English
Date of oral exam:	22 October 2008
Referee:	Name Academic Title Langer, Thomas Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2631