Universität zu Köln

Jaeger, Verena-Maren (2009). Analyse der MACF1 Isoform-3 Funktionen, einem Spektraplakin Protein mit dualen Rollen im Zytoplasma und dem Nukleus. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

ZUSAMMENFASSUNG Das Spektraplakin Familienmitglied MACF1 (Microtubule Actin Cross-linking Factor 1) ist ein großes (620-800 kDa) Multidomänenprotein, welches Mikrofilamente und Mikrotubuli quervernetzt. Das MACF1 Gen kodiert für verschiedene alternativ gespleißte Isoformen, die in Größe, Länge und Domänenkomposition variieren. MACF1 Isoform-3 weist einen ungewöhnlichen N-Terminus auf, der auf neue Funktionen schließen lässt. Dieser ist aus einem einzigartig hoch konservierten 35 kDa N-Terminus aufgebaut, der direkt an die zweite Hälfte der Aktin-bindenden Domäne fusioniert ist. Die transiente Expression dieses N-Terminus inhibiert die Signaltransduktion der Rho-GTPasen. Durch die Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid Systems und Expressionsstudien konnte eine Interaktion mit dem Zytoskelettmodulator RhoA gezeigt werden. Immunfluoreszenzstudien mit einem neu generierten polyklonalen MACF1 Isoform-3 Antikörper zeigten eine ungewöhnliche Lokalisierung um und innerhalb des Nukleus in verschiedenen Zelllinien und Geweben zusätzlich zu der gut charakterisierten Mikrotubuli Lokalisation. Permeabilisationassays mit Digitonin wiesen auf die Lokalisation von MACF1 Isoform-3 an der äußeren Kernhülle hin. Dort kolokalisiert MACF1 mit Nesprinen. Nesprine sind integrale Membranproteine der äußeren Kernhülle, die den Zellkern mit dem Zytoskelett verbinden. Durch GST-Proteininteraktions-, Immunpräzipitations-, Hefe-Zwei-Hybrid- und Expressionsstudien konnte eine Interaktion von MACF1 Isoform-3 mit Nesprin-3 gezeigt werden. Weiterhin deuten die Ergebnisse an, dass durch diese Interaktion MACF1 Isoform-3 Mikrotubuli an die Kernhülle transloziert und dort stabilisiert. Während der Mitose lokalisiert MACF1 Isoform-3 entlang der mitotischen Spindel. Durch Chromatin Immunpräzipitation und Expressionsstudien konnte eine neue Assoziation mit Chromatin und Laminen für MACF1 Proteine gezeigt werden. Weiterhin konnten erste Belege für Umlagerungen von MACF1 Isoform-3 gezeigt werden. Durch Zugabe von Wachstumsfaktoren (Wnt-3, HGF und TGFß) sowie durch Serumsentzung und Zugabe von Calzium-Ionen konnte in Immunfluoreszenzstudien die subzelluläre Verteilung von MACF1 Isoform-3 beeinflusst werden, wobei MACF1 Isoform-3 nach Serumentzug mit Mitochondrien kolokalisierte. Ein möglicher Interaktionspartner an den Mitochondrien ist DISC1 (Disrupted in Schizophrenia 1), das als high risk gene für die Entstehung von Schizophrenie gilt. Durch Hefe-Zwei-Hybrid (Carmago et al., 2006) Immunpräzipitations- und Expressionsstudien wurde eine Interaktion mit MACF1 Isoform-3 nachgewiesen. Diese Daten deuten an, dass MACF1 Isoform-3 eine mögliche Funktion in der Entstehung von Schizophrenie besitzt. Wir stellen daher die Hypothese auf, dass MACF1 Isoform-3 eine wichtige Rolle in der Migration und Proliferation von Zellen ausübt und hierbei in die RhoA- und Wnt Signaltransduktion involviert ist.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Analysis of MACF1 isoform-3, a spectraplakin with dual functions in the cytoplasm and the nucleus German
Translated abstract:	Abstract Language ABSTRACT MACF1 (Microtubule Actin Cross-linking Factor 1, 620-800 kDa) is a multidomain protein that associates with microfilaments and microtubules. The MACF1 gene encodes several alternatively spliced transcripts, which differ in length, domain composition and their expression pattern. In particular, MACF1 isoform-3 shows an unusual N-terminus, which suggests novel functions. It is composed of a unique and highly conserved 35 kDa segment that is fused to the second half of the actin-binding domain, which when overexpressed inhibits Rho-GTPase signalling. Using the yeast two hybrid and transfection assays we document an isoform-3 functional association with the cytoskeleton modulator RhoA. By employing a specific antibody against isoform-3, we reveal for the endogenous MACF1 protein an unusual localization pattern in and around the nucleus in various cell lines and tissues, in addition to its well-characterized microtubule-network pattern. Utilizing selective plasmamembrane permeabilization assays we demonstrate the presence of the MACF1 isoform-3 at the outer nuclear envelope, where it colocalizes with Nesprins. Nesprins are specific integral nuclear envelope proteins that facilitate the integration of the nuclear surface with the surrounding cytoskeleton. Using GST-pulldown, immunoprecipitation and colocalization studies, we demonstrate the association of the MACF1 N-terminus with Nesprin-3. Furthermore our results suggest that MACF1 isoform-3 tethers and stabilizes microtubules at the nuclear envelope. During mitosis, however, MACF1 isoform-3 localizes at the mitotic spindle apparatus. Using chromatin immunoprecipitation and transfection assays, we document novel nuclear functions for MACF1 that include associations with chromatin and the nuclear lamina. We provide compelling evidence underlining the dynamic nature of the MACF1 molecule. In particular, we show that its subcellular localization is influenced by serum starvation, calcium-ions, Wnt-3, TGF-ß and HGF growth factors treatment. Strikingly, upon serum starvation MACF1 isoform-3 colocalized with mitochondria. By performing immunoprecipitation and transfection studies, we identify the high risk gene for schizophrenia DISC1 (Disrupted in Schizophrenia 1), a well described mitochondria binding protein, as a novel functional binding partner for MACF1 isoform-3. These results suggest a potential role for MACF1 isoform-3 in the schizophrenia pathogenesis. In summary our data suggest novel and multiple functions for MACF1 isoform-3 in cellular architecture and the Wnt- and RhoA-signalling pathways. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Jaeger, Verena-Maren jaegerv@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26485
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Spektraplakin, MACF1, Nesprin-3, Zellkern German spectraplakin, MACF1, nucleus, nesprin-3 English
Date of oral exam:	5 February 2009
Referee:	Name Academic Title Noegel, A. A. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2648