Universität zu Köln

Xavier, Charles-Peter (2009). Functional characterization of human CRN2 (coronin-1C) in normal and disease conditions. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Coronins are in general versatile actin filament-crosslinking and bundling proteins. In human, seven subfamilies of coronins are identified. One of these proteins found ubiquitously expressed in human tissues is CRN2 (synonyms: coronin-1C, coronin-3). Here, we study in vivo and in vitro F-actin associated properties of CRN2. Using different GFP tagged structural domain proteins and RNAi mediated knock down of CRN2, we studied the role of these domains in various cellular activities like wound healing, formation of protrusions, proliferation, cytokinesis and endocytosis. We found an inhibitory effect of the WD repeat or coiled coil domain of CRN2 in specific to be profound on wound closure and formation of cellular protrusions. Screening of the CRN2 protein sequence for posttranslational modifications resulted in identification of Ser463 as a putative serine phosphorylation site located in the coiled coil domain. An important cytoskeleton regulator, CK2á kinase, was found to interact and phosphorylate this residue. The consequence of this phosphorylation is to regulate oligomerization of this domain as evident from gel filtration studies. Further, at the cellular level it induced a significant inhibitory effect on wound closure and cell protrusion as studied using a phosphomimetic S463D mutation. CRN2 like other coronins interacted with the Arp2/3-complex and cofilin. In addition, both wild type and phosphomutant CRN2 executed an inhibitory effect on Arp2/3-mediated actin polymerisation, however, this effect was more pronounced in the case of phosphomutant. Two novel CRN2 isoforms which differ in their N-terminal length were found to arise from an alternative exon, exon 1a, identified in intron 1. All three isoforms co-localize with and associate with F-actin. Biochemical evidence suggests that, in contrast to the conventional isoform 1 and the longer isoform 2, the largest isoform 3 exists as a monomer. Structural modelling reveals that this difference in the oligomerization state may result from an interaction of the elongated N-terminus of CRN2-isoform 3 with the C-terminal coiled coil. In addition, this isoform, which is expressed during the myogenic differentiation and in mature skeletal muscle tissue, was found as a novel component specifically localizing to sarcomeric F-actin as well as to the motor end plate. Further we performed a detailed study on the expression pattern of CRN2 in human brain tumours. We found a correlation between the number of CRN2 positive cells and the malignant phenotype in diffuse gliomas. In addition, CRN2 knockdown glioblastoma cells exhibited significantly reduced levels of cell proliferation, motility and invasion into the extracellular matrix. Our findings provide evidence for a contribution of CRN2 in the malignant progression of diffuse gliomas.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language funktionelle Charakterisierung des humanen CRN2 (Coronin-1C) German Functional characterization of human CRN2 (coronin-1C) English
Translated abstract:	Abstract Language Coronine gelten als vielseitige Aktinfilament-vernetzende und -buendelnde Proteine. In menschlichen Zellen wurden sieben Mitglieder der Coronin-Familie identifiziert. Eines dieser Coronine, das ubiquitaer exprimiert wird, ist CRN2 (Synonmye: Coronin-1C, Coronin-3). In dieser Arbeit untersuchten wir die mit Aktinfilamenten assoziierten Funtionen von CRN2. Mit verschiedenen GFP-Fusionsproteinen von CRN2-Domaenen und einer RNAi-vermittelten Herunterregulation von CRN2 haben wir als Funktionen von CRN2 z.B. die in vitro Wundheilung, Ausbildung von Zellfortsaetzen, Proliferation, Zellteilung und Endozytose ermittelt. Dabei fanden wir hemmende Effekte verschiedener CRN2-Domaenen, insbesondere in der Wundheilung und Ausbildung von Zellfortsaetzen. Eine Analyse der CRN2 Aminosaeuresequenz hinsichtlich posttranslationaler Modifikationen zeigte Ser463 in der Coiled coil-Domaene als eine moegliche Phosphorylierungsstelle. Wir konnten hier zeigen, dass die Kinase CK2, ein wesentlicher Regulator des Zyoskeletts, mit Ser463 interagiert und diesen Rest phosphoryliert. Als eine Konsequenz aendert sich der Oligomerisierungsstatus von CRN2, wie mit Gelfiltrationsexperimenten belegt werden konnte. Weiterhin zeigten Experimente mit der phosphomimetischen S463D CRN2-Variante signifikant hemmende Effekte auf die Wundheilung und Ausbildung von Zellfortsaetzen. CRN2 interagiert wie andere Coronine mit dem Arp2/3-Komplex und mit Cofilin. Diesbezueglich zeigten Aktinpolymerisations-Versuche einen ausgepraegten hemmenden Effekt von normalem wie auch S463D CRN2, wobei die Mutante eine deutlichere Hemmung aufwies. Wir haben zwei neue Isoformen des CRN2 beschrieben, die sich in der Laenge des N-Terminus unterscheiden und durch Spleissen eines alternativen Exons entstehen. Alle drei Isoformen kolokalisieren und assozieren mit F-Aktin. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass die laengste Isoform 3 nicht wie die anderen beiden als Trimer, sondern als Monomer vorliegt. Strukturmodelle liessen hier vermuten, dass der Unterschied im Oligomerisierungsstatus von einer Interaktion des verlaengerten N-Terminus mit dem C-Terminus herruehrt. Die Isoform 3 wurde waehrend der myogenen Differenzierung exprimiert und ist die alleinige Isoform in reifem Skelettmuskel. Hier haben wir CRN2 als eine neue Komponente des Sarkomers und der motorischen Endplatte beschrieben. Darueberhinaus haben wir eine detaillierte Studie zur Expression von CRN2 in humanen Hirntumoren durchgefuehrt. Es zeigte sich eine Korrelation zwischen der Anzahl CRN2-positiver Tumorzellen mit dem malignen Phaenotyp Diffuser Gliome. Die Herunter-regulation von CRN2 in humanen Glioblastomzellen ergab signifikant verminderte Raten von Proliferation, Motiliaet und Invasion in die Extrazellularmatrix. CRN2 koennte ein Faktor fuer die Ausbreitung oder die schlechte Prognse von Diffusen Gliomen sein. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Xavier, Charles-Peter cxavier@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26564
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Coronin 1C, Arp 2/3, Oligomerisierung German Coronin 1C, Arp2/3, Oligomerisation English
Date of oral exam:	15 February 2009
Referee:	Name Academic Title Noegel, A. A. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2656