Universität zu Köln

Holleben, Max v. (2009). Functional Characterisation of SLy2 as a novel regulator of the actin cytoskeleton. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

This thesis represents the first molecular characterisation of SLy2, a novel member of the recently described SLy family of adapter proteins. SLy2 was previously identified as HACS1 on the basis of its deregulated expression in different hematopoietic cancer cell lines (Claudio et al., 2001). Database analysis defined an identical modular organisation of SLy and SLy2, with an N-terminal NLS-, a central SH3- and a C-terminal SAM domain. SLy2 is expressed throughout the hematopoietic tissues, but also in muscle, heart, brain and colon. In vivo overexpression in B cells of a transgenic mouse line established a role for SLy2 in the initial spreading and contraction of B cells in response to contact with antigen containing surfaces. In vitro overexpression of wildtype SLy2 protein in HeLa cells resulted in the prominent and robust induction of branched F-actin structures like lamellipodia and peripheral ruffles, to which SLy2 also specifically localised. This primary effect was accompanied by markedly enhanced spreading and correlated with diminished proliferation, most probably due to defective cytokinesis in SLy2 overexpressing cells. A detailed analysis of HeLa cells overexpressing different SLy2 deletion mutants could define the impact of the various domains on the function of SLy2 and especially demonstrated the importance of the SH3 domain. Furthermore, the conserved serine residue 23 could be identified as a potential switch for regulating SLy2 activity. Overexpression studies with different point mutants of Rac1 suggested a direct role for this small GTPase in the SLy2 induced F-actin structures, as dominant negative Rac1-N17 abrogated the F-actin inducing effects of SLy2, while constitutively active Rac1-V12 even enhanced this phenotype. Ultimately, the members of the cortactin family of nucleation promoting factors, cortactin and its lymphocyte homolog HS1 could be identified as interaction partners of SLy2. As their role in the induction of lamellipodia and immunological synapses has been clearly established before, they are highly likely to represent the downstream effectors of SLy2 activity. With the generation of gene targeted SLy2 deficient mice, an in-depth analysis of this novel regulator of branched F-actin structures in vivo is now possible.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die vorliegende Dissertation stellt die erste molekulare Charakterisierung des Proteins SLy2 dar. Auf Grund des hohen Expressionslevels in Zellen des hämatopoietischen Systems und seiner markanten Domänenstruktur ist SLy2 ursprünglich als hematopoietic adapter protein containing SH3 and SAM domains 1 (HACS1) beschrieben worden (Claudio et al., 2001). Eine Analyse der molekularen Struktur auf Grund von Datenbankvergleichen ergab einen zu SLy hochidentischen Aufbau, bestimmt durch eine N-terminale Kern-Lokalisationssequenz (NLS), eine zentrale SH3 und eine C-terminale SAM Domäne. Es konnte gezeigt werden, dass SLy2 sowohl in allen hämatopoietischen Geweben, als auch in Muskel, Herz, Gehirn, Dünndarm und Pankreas exprimiert wird. In vivo führte eine verstärkte Expression von SLy2 in transgenen murinen B Lymphozyten zu einer Störung der Zellausdehnung und -kontraktion während der frühen Antwort auf oberflächen-fixierte Antigene. In vitro bedingte eine Überexpression von SLy2 in HeLa Zellen die Bildung von Membrankrausen und Lamellipodien, beides von verzweigtem F-Aktin geprägte zelluläre Strukturen. Es wurde außerdem eine spezifische Lokalisation von SLy2 in diesen Strukturen beschrieben. Als sekundärer Effekt wurde eine deutlich beschleunigte Ausbreitung dieser Zellen auf mit Gelatine beschichteten Oberflächen gezeigt. Auffällig war außerdem die verminderte Zellteilungsaktivität der transgenen Zellen, die wahrscheinlich auf einer gestörten Zytokinese beruht, was durch das verstärkte Auftreten von Zytoplasma-Brücken, sog. Zytonemen zwischen den SLy2-transgenen HeLa Zellen nahegelegt wurde. Interessanterweise tragen die verschiedenen Domänen von SLy2 zu unterschiedlichem Ausmaß zu diesem Phänotyp bei. Während eine SLy2-Mutante ohne die NLS nur mehr einen sehr eingeschränkten Einfluss auf die genannten zellulären Strukturen nahm, bedeutete die Beseitigung der SH3 Domäne beinahe einen kompletten Verlust der Lamellipodien-induzierenden Aktivität. Der Effekt der SAM Domäne konnte nicht abschließend evaluiert werden, da eine Mutante ohne diese Domäne nur zu einem deutlich verminderten Ausmaß exprimiert wurde. Allerdings zeigen auch Zellen mit hoher Expression dieser Mutante einen weitgehend wildtypischen Phänotyp. Die Punktmutation eines konservierten Serin-Restes im N-Terminus (Serin 23) zu Alanin resultierte in einer Verstärkung des beschriebenen Effekts auf Membrankrausen und Lamellipodien. Stimmigerweise zeigten Zellen mit dieser Mutante auch die stärksten Zellteilungsdefekte. Dies ist vor allem vor dem Hintergrund interessant, dass das analoge Serin 27 in SLy als Ziel der PKD ausgemacht wurde. Beide Ergebnisse legen eine regulatorische Funktion dieser Aminosäure nahe (Astoul et al., 2003). Durch die Überexpression von verschiedenen Rac1 Punktmutanten konnte eine Einflussnahme dieser kleinen GTPase auf die von SLy2 bedingten F-Aktin Strukturen gezeigt werden. Die dominant negative Mutante Rac1-N17 verhinderte bei gleichzeitiger Expression mit SLy2 die Bildung der auffälligen Membranstrukturen. Dem gegenüber bedingte die Expression der allzeit aktivierten Variante Rac1-V12 noch eine zusätzliche Verstärkung des SLy2 Effektes. Schlussendlich konnten die beiden Proteine der Cortactin Familie, Cortactin und das lymphozyten-spezifische HS1 als Interaktionspartner ausgemacht werden. Da die Rolle dieser beiden Adaptoren in der Bildung von verzweigten F-Aktin Strukturen bereits klar definiert wurde, stellen sie vielversprechende Effektoren für die von SLy2 ausgelösten F-Aktin Zytoskelett Veränderungen dar. Die in dieser Arbeit generierte SLy2-defiziente Mauslinie wird in Zukunft eine tiefgreifende in vivo Analyse der Effekte dieses Proteins auf das Aktin Zytoskelett ermöglichen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Holleben, Max v. max.holleben@uni-duesseldorf.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-26599
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language SLy2 , Cytoskeleton , Cortactin English
Date of oral exam:	2 February 2009
Referee:	Name Academic Title Brüning, Jens Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2659