Universität zu Köln

Bouabe, Hicham (2008). Etablierung von Interleukin-10 (IL-10)-Reportermäusen zur Identifizierung der IL-10-produzierenden Zellen in vivo. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Das Cytokin Interleukin-10 (IL-10) ist eines der wichtigsten Immunsuppressoren, das die Inflammation limitiert und für eine ausgewogene nichtpathologische Immunantwort sorgt. Um die IL-10-produzierenden Zellen in vivo bzw. ex vivo zu identifizieren und IL-10-Genregulation zu analysieren, wurde eine IL-10-IRESEGFP-Reportermaus etabliert. Mit diesem Reportermausmodell konnte EGFP-Expression nur in T-Zellen detektiert werden. Um eine höhere Reportersensitivität zu erreichen, wurden mehrere Reporterkonstrukte generiert und im Zellkultursystem getestet. Mittels IRES-vermittelter polycistronischer Reportervektoren wurde festgestellt, dass die Reporteraktivität proportional zu der Anzahl der IRES-EGFP-Sequenzen ansteigt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Cap-abhängige Translation und die posttranskriptionale Regulation mittels der 3'-nichttranslatierten Region (3'-UTR) nicht durch multiple IRES-EGFP-Sequenzen beeinträchtigt werden. Um die Reproduzierbarkeit der erzielten Ergebnisse in einem transgenen Mausmodell zu testen, wurde ein polycistronischer Reporter-Targeting-vektor, IL10-3xIRESEGFP, generiert und mittels homologer Rekombination ins Genom von Maus-ES-Zellen integriert. Die IL10-3xIRESEGFP-Reportermaus, die aus den bereits geborenen chimären Mäusen etabliert wird, sollen in weiterführenden Studien umfassend untersucht werden. Um bei dem sehr schwachen IL-10-Promoter eine nachweisbare Reporteraktivität in vivo/ex vivo zu erzielen, wurde in einem zweitem Ansatz das polycistronische Reportersystem mit dem ß-Lactamase-Gen verwendet und eine IL10-2xIRES-Bla-Reportermaus (IL10-Bla-Maus) generiert. Mit dieser Reportermaus konnte die Reporteraktivität wesentlich verbessert werden. Es konnte unter physiologischen Bedingungen die Bla-Reporteraktivität in DCs, Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, NK-Zellen und PMNs, in vitro und ex vivo detektiert werden. Außerdem ermöglicht die IL10-Bla-Reportermaus kinetische Echtzeitexpressionsstudien. Im Unterschied zu IL10-EGFP-Reportermaus, konnte bei im Yersinia-Ifektionsmodell mit der IL10-Bla-Maus Reporteraktivität in verschiedenen Zelltypen ex vivo detektiert werden. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde ein Modell zum zellulären Expressionsprofil von IL-10, bezeichnet als autokrine IL10-abhängige Regulation, vorgeschlagen und die IL-10-Expressionsdaten in diesem Kontext diskutiert.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Establishment of Interleukin-10 (IL-10) Reporter mice to identify IL-10 producing cells in vivo English
Translated abstract:	Abstract Language The cytokine Interleukin-10 (IL-10) is one of the most important immune suppressors which limits inflammation and enables a balanced nonpathogenic immune response. In order to identify IL-10-producing cells in vivo and ex vivo, respectively, an IL10-IRESEGFP-Reporter mouse was established. In this reporter mouse model EGFP-flourescence was only detectable in T cells. In order to achieve higher reporter sensitivity, several reporter constructs were generated and tested in cell culture system. Using IRES-mediated polycistronic reporter vectors it was shown, that reporter activity increases proportional to the number of IRES-EGFP-repeats. In addition it was shown that multiple IRES-EGFP-sequences did neither influence Cap-dependent translation nor posttranscriptional regulation by 3'-untranslated region (3'-UTR). To test the functionality of this IRES-mediated polycistronic reporter system in a transgenic mouse model, a targeting polycistronic reporter vector, IL10-3xIRESEGFP, was generated. This vector was integrated into the genome of the mouse embryonic stem cells (ES) by homologous recombination. The IL10-3xIRESEGFP-reporter mouse which will be established from already born chimeras will be investigated in further studies. To overcome the limits of reporter detection by the weak IL-10 promoter in a second approach we established a polycistronic reporter targeting vector by using ß-lactamase as reporter gene to generate an IL10-2xIRESBla-reporter mouse (IL10-Bla-mouse). This IL10-Bla-reporter mouse showed a strongly improved reporter activity. Under physiological conditions Bla-reporter activity could be detected in DCs, macrophages, B cells, T cells, NK cells and PMNs, in vitro and ex vivo. In addition the IL10-Bla-reporter mouse enables kinetic and real time expression studies. In contrast to the IL10-EGFP-reporter mice, Bla-reporter activity could be detected by in vivo infection studies in various cell types of the IL10-Bla-reporter mouse. On the basis of these results a model for the cellular expression profile of IL-10, called autocrine IL-10-dependent Regulation, was suggested and the obtained IL-10-Reporter results were discussed in this context. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bouabe, Hicham bouabe@mvp.uni-muenchen.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-27143
Date:	2008
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language IL-10, Cytokine, Immunregulation, Reportermäuse, Reportergen, EGFP, ß-Lactamase German IL-10, cytokines, immune regulation, reporter mice, reporter gene, EGFP, ß-lactamase English
Date of oral exam:	10 February 2008
Referee:	Name Academic Title Howard, Jonathan C. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2714