Universität zu Köln

Jolkver, Elena (2008). Identification and characterization of carboxylate transporters in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Transport processes play an important role in cellular fluxes due to the impermeability of the plasma membrane for most substrates. The understanding of carboxylate metabolism is of particular interest for fundamental research, approaching the goal of a complete understanding of metabolic pathways. Biotechnological applications benefit from this knowledge, since production processes can be improved by increasing the yield and reducing the production costs. At the beginning of this work, the transport processes contributing to carboxylate uptake and excretion were largely unknown. Here, several carboxylate transporters were identified and characterized and some putative transporters were suggested, thus promoting the global understanding of carboxylate metabolism in the biotechnologically important organism C. glutamicum. The pyruvate importer MctC was identified and proven to be a high-affinity acetate and propionate carrier. It was shown to be indispensable for pyruvate utilization and to contribute substantially to acetate and propionate uptake under natural conditions of low substrate availability. The activity of MctC was found to depend on the carbon source present in the medium and its transcription was regulated by the major regulators of acetate metabolism RamA and RamB. Furthermore, it was shown to be transcribed in an operon with a small membrane protein encoding gene cgl0832. The characterization of spontaneous mutants, which were able to grow on succinate, fumarate, or L-malate, led to the identification of the transporters DccT and DctA. DccT was proven to be a secondary active, Na+ dependent C4-dicarboxlyate importer. Its presence promoted aerobic growth on succinate, fumarate, L-malate, and oxaloacetate. DctA was also verified to confer dicarboxylate uptake ability. In contrast to DccT, DctA was shown to depend on the electrochemical proton potential and to accept many structurally different carboxylates as substrates, including the C6-tricarboxylate citrate, the C5-dicarboxylate 2-oxoglutarate, the C4-dicarboxlyates succinate, fumarate, L-malate, oxaloacetate, and aspartate, as well as the monocarboxylates glyoxylate and lactate, albeit its substrate affinity was found to be lower than that of DccT. Several different approaches were undertaken in order to identify carboxylate exporters. Although none of them was successful for the identification of a lactate exporter, a putative succinate exporter was suggested by the characterization of site-directed mutants during oxygen deprived conditions. The analysis of gene expression under pyruvate producing conditions as well as phenotypic analysis of site-directed mutants pointed to several putative pyruvate exporters.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Identifizierung und Charakterisierung von Carboxylattransportern in Corynebacterium glutamicum German
Translated abstract:	Abstract Language Aufgrund der eingeschränkten Membranpermeabilität für die meisten Substrate, ist deren Transport entscheidend für die Aufrechterhaltung des Metabolismus und damit ein wichtiger Faktor für das Verständnis des Stoffwechsels. Der Transport von Carboxylaten im biotechnologisch bedeutenden Bakterium C. glutamicum war bisher weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es, ein möglichst umfangreiches Verständnis vom Carboxylattransport zu gewinnen, indem bereits vorgeschlagene Carboxylatcarrier charakterisiert und neue Systeme identifiziert werden sollten. Der Pyruvatimporter MctC wurde identifiziert und biochemische Analysen belegten seine Funktion als hochaffines Acetat- und Propionataufnahmesystem. Es wurde gezeigt, dass es essentiell für die Verwertung von Pyruvat ist und maßgeblich zur Acetat- und Propionataufnahme unter natürlichen limitierten Bedingungen beiträgt. Die Transkription von mctC findet im Operon mit cgl0832 statt und wird von den beiden Hauptregulatoren des Acetatmetabolismus RamA und RamB in Abhängigkeit von der angebotenen Kohlenstoffquelle bestimmt. Die Charakterisierung von Spontanmutanten, die auf succinat-, fumarat- oder L-malathaltigem Medium isoliert wurden, erlaubte die Identifizierung der beiden Dicarboxylattransporter DccT und DctA. Biochemische Studien zu DccT belegten, dass es ein sekundär aktiver, Na+-abhängiger Transporter ist. Durch seine Anwesenheit wird das aerobe Wachstum von C. glutamicum auf Succinat, Fumarat, L-Malat und Oxalacetat ermöglicht. Zusätzlich vermittelt auch die Anwesenheit von DctA die Fähigkeit zur Dicarboxylataufnahme. Im Gegensatz zu DccT ist DctA ein protonenabhängiger Transporter, der eine Vielzahl strukturell unterschiedlicher Substrate bindet. Im Vergleich mit DccT zeigte DctA jedoch eine geringere Substrataffinität. Durch Genexpressionsstudien unter Pyruvat produzierenden Bedingungen sowie durch die phänotypische Charakterisierung einiger ortsgerichteter Mutanten unter O2 limitierten Bedingungen konnten Transporter identifiziert werden, die möglicherweise am Export von Pyruvat und Succinat beteiligt sind. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten liefern ein umfangreiches Verständnis der Carboxylataufnahme und -exkretion in C. glutamicum. Damit können biotechnologische Anwendungen durch gezielte Eingriffe in die Transportvorgänge maßgeblich verbessert werden, wodurch die Substratausbeute gesteigert und damit die Produktionskosten gesenkt werden können. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Jolkver, Elena jolkver.elena@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-27168
Date:	2008
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Corynebacterium , Transport , Carboxylat , Pyruvat , Dicarboxylat German Corynebacterium , transport , carboxylate , pyruvate , dicarboxylate English
Date of oral exam:	24 November 2008
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2716