Universität zu Köln

Raaf, Jennifer (2009). Molekulare Interaktionen der Proteinkinase CK2 und ihrer Untereinheiten. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Proteinkinase CK2 ist ein heterotetrameres Enzym, bestehend aus zwei räumlich getrennten katalytischen Ketten (CK2alpha), die mit einem Dimer nicht-katalytischer Untereinheiten (CK2beta) verbunden sind. Zusammen mit den cyclinabhängigen Kinasen und den mitogen-aktivierten Proteinkinasen gehört CK2alpha zur CMGC-Familie der eukaryontischen Proteinkinasen (EPKs). CK2 ist hochkonserviert und in viele wichtige zelluläre Prozesse, wie Zellzyklus, Apoptose, Stressantwort und Tagesrhythmus involviert. In vielen Tumoren wird erhöhte CK2-Aktivität beobachtet, was die Proteinkinase CK2 zu einem attraktiven Ziel von Inhibitoren macht. Obwohl CK2 schon seit über 50 Jahren bekannt ist, sind die Details der Funktion nicht verstanden und die Einordnung in die Signaltransduktionswege und regulatorische Netzwerke der Zelle unklar. Die Gründe dafür sind die extrem hohe Anzahl von Substraten (über 300) und der Mangel an (bekannten) Regulations­mechanismen. Im Gegensatz zu ihren streng regulierten nächsten Verwandten, ist CK2alpha auch abseits des CK2-Holoenzyms katalytisch aktiv. CK2beta ist kein An- und Ausschalter von CK2alpha, sondern moduliert die Substratspezifität, erhöht die Thermostabilität und die Aktivität und dient als Andock­stelle für andere Proteine. Inzwischen gibt es viele Hinweise dafür, dass das CK2-Holoenzym kein permanenter Komplex ist, sondern in einem dynamischen Gleichgewicht mit seinen Untereinheiten steht. In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionen der Untereinheiten miteinander und mit kleinen organischen Molekülen unter der Verwendung strukturbiologischer, kalorimetrischer und enzymkinetischer Methoden untersucht. Es konnte die Struktur von hsCK2alpha1-335 mit dem ATP-kompetitiven Inhibitor Emodin aufgeklärt und mit einem zuvor veröffentlichten Komplex von Emodin und CK2alpha aus Mais verglichen werden. Trotz einer Sequenzidentität von über 77 % unterscheiden sich die beiden Strukturen in der Orientierung des Inhibitors und den lokalen Konformationen in der Nucleotidbindungsstelle. Des Weiteren konnte bei einer hsCK2alpha1-335-Komplexstruktur mit dem Inhibitor 5,6-Dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazol (DRB) ein dualer Bindungsmodus festgestellt werden, der sich auch durch eine gemischte Inhibitionskinetik äußerte. Ein DRB-Molekül bindet an die kanonische ATP-Bindungsstelle, das Zweite an die CK2alpha/CK2beta-Kontaktfläche und zeigte bei DSC-Messungen einen destabilisierenden Einfluss auf das CK2-Holoenzym. Wie auch bei der Komplexstruktur mit Emodin schränkte die Gelenkregion auch hier den Platz in der Nucleotidbindungsstelle durch eine geschlossene Konformation ein. Mit einer zusätzlich durch­geführte Röntgendiffraktionsmessung bei einer Wellenlänge von 2 Å, konnten anomale Streuer lokalisiert werden. Auf diese Weise wurden die DRB-Positionen verifiziert und die Chlor- und Schwefelsubstruktur des Komplexes aufgeklärt. In einer bereits veröffentlichten Struktur einer hsCK2alpha-Punktmutante, bei der eine ähnliche Kristallpackung wie bei dem Komplex mit DRB vorlag, zeigte sich, dass an der allosterischen Bindungsstelle auch Glycerin binden kann. Die Bindung von Glycerin konnte durch eine Co-Kristallisation reproduziert werden und die daraus resultierende Struktur zeigte eine inaktive Konformation. Bis jetzt wurde CK2alpha ausnahmslos in der aktiven Form gefunden, die bei CK2alpha durch verschiedene intramolekulare Kontakte stabilisiert wird. Bei der inaktiven Form bleiben die regulatorischen Schlüsselelemente in der für EPKs typischen aktiven Konformation, während die glycinreiche Schleife in die ATP-Bindungsstelle kollabiert und so die Bindung von ATP verhindert. Auch hier wurde, wie bei den Komplexstrukturen mit Emodin und DRB, der geschlossene Zustand der Gelenkregion beobachtet, der ebenfalls ein Mechanismus der Inaktivierung sein könnte. Anhand dieser Struktur konnte zum ersten mal die strukturelle Basis für den stimulierenden Einfluss von CK2beta auf CK2alpha erklärt werden. Mit isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) konnte festgestellt werden, dass die Assoziation der CK2-Untereinheiten stark exotherm ist und der enthalpische Beitrag die treibende Kraft der Bindung ist. Auf Grund der hydrophoben Interaktions­fläche wurde eher ein signifikant positiver entropischer Beitrag zu deltaG° erwartet, der aus der Freisetzung hochgeordneter Wassermoleküle resultiert. Insgesamt stellt sich die katalytische Untereinheit der Proteinkinase CK2 in der vorliegenden Arbeit als Protein dar, bei dem durch die Bindung verschiedener Liganden und den Vergleich der Komplexe lokale Flexibilität sichtbar wird, die sich zusammen mit der Annahme eines transienten CK2-Holoenzyms, durchaus im Sinne einer regulierten Kinase interpretieren lässt.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Molecular interactions of protein kinase CK2 and its subunits English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Raaf, Jennifer raafj@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-27865
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Proteinkinase , CK2 , Kinase-Inhibitoren , Röntgenstrukturanalyse , Kalorimetrie German protein kinase, CK2 , kinase inhibitors , X-ray crystallography , calorimetry English
Date of oral exam:	24 June 2009
Referee:	Name Academic Title Niefind, Karsten PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2786