Universität zu Köln

Märsch, Stephan (2009). Combinatorial engineering of adeno associated virus vectors. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Verwendung viraler Vektoren als Genfähren zum Transfer therapeutische Gene in menschliche Zellen wird seit über zwei Jahrzehnten erforscht. Trotz aufregender Neuerungen und vielversprechender Ergebnisse aktueller Tierexperimente und klinischer Studien muss die Sicherheit und Effektivität dieser neuen Technologie noch weiter verfeinert werden. Das Adeno-assoziierte Virus vom Serotyp 2 (AAV2), ein sicheres, effektiv herstellbares Virus ist einer der beliebtesten Vektoren zum Einsatz in der Gentherapie, da es eine stabile Genexpression in einem breiten Spektrum verschiedener Zelltypen über lange Zeit ermöglicht. Zwei Nachteile behindern den Einsatz dieses Virus jedoch in besonderem Maße: Auf der einen Seite zieht der breite Tropismus bei systemischer Gabe die unspezifische Transduktion von Geweben nach sich, die nicht infiziert werden sollen. Zum Zweiten ist ein Großteil der Menschheit schon unbemerkt mit dem Virus in Kontakt gekommen und verfügt über neutralisierende Antikörper, welche die Transduktion der Zielzellen durch die Genfähren verhindern. Ziel der beiden Projekte meiner Arbeit war die Entwicklung neuer kombinatorischer Strategien um die oben genannten Einschränkungen zu beseitigen. In einem Projekt wurde ein in-vitro Protokoll entwickelt, mit dem Virusmutanten mit gesteigerter Spezifität für eine Melanomzelllinie (BLM) aus einer kombinatorischen "Viruslibrary" selektiert werden konnten. Das Protokoll besteht aus einem Negativselektionsschritt auf Fibroblasten und einem anschließenden Positivselektionsschritt auf BLM-Zellen. Die selektierten Mutanten zeigten mit Wildtyp vergleichbare Infektionslevel auf BLM-Zellen und signifikant herabgesetzte Transduktion der Fibroblasten und weiterer Nicht-Zielzellen. Im zweiten Projekt habe ich eine neuartige "AAV2-Kapsidlibrary" generiert, in der fünf zuvor als wichtig für Antikörperbindung charakterisierte Aminosäurepositionen vollständig randomisiert wurden. Nach vier Selektionsrunden mit neutralisierendem Serum konnte ich mehrere Mutanten isolieren, die trotz Anwesenheit von Serumkonzentrationen infektiös waren, welche den Wildtyp vollständig neutralisierten.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Optimierung des Adeno-assoziierten Virus durch kombinatorische Techniken German
Translated abstract:	Abstract Language The use of viral vectors as delivery vehicles for therapeutic genes (gene therapy) is being investigated and improved since two decades. Despite exciting advances and promising results in animal studies and clinical trials, technical refinements are still needed to improve efficiency and safety of gene transfer. One of the most popular vector types derives from adeno associated virus of type 2 (AAV2). This virus has attracted the interest of gene therapists being safe, easy to produce at high titers and offering the possibility to target a plethora of cell types and to maintain detectable levels of transgene expression for long times. However, two major limitations hamper the use of this vector type. First, the broad tropism of AAV means that vectors are rather unspecific and therefore likely to infect neighboring tissues. Second, high seroprevalence in human populations of antibodies directed against wtAAV2 capsids reduces or abolishes transduction rates in individuals with pre-existing immunity. The goal of my work was to address these two major issues and develop new methods to engineer AAV capsid variants with increased target selectivity and decreased antibody recognition. Within a first project, I established for the first time a straight-forward in vitro protocol for the selection of viral mutants with increased selectivity for a melanoma cell line (BLM) out of a combinatorial viral library. The selection procedure consisted of a negative selection step on non-target cells and a positive selection step on BLM cells. Selected mutants showed almost wt levels of infectivity on BLM cells while transducing several tested non-target cells with a significantly lower efficiency, resulting in a up to 3.7-fold increase of target specificity. Within the second project I generated a novel AAV2 capsid library by randomizing five amino acid residues that had been previously reported to play a role in antibody docking to the viral shell. Screening this library for particles that remained infectious despite pre-incubation with neutralizing antibodies allowed the isolation of several capsid variants that remained highly infectious even in the presence of antibody concentrations that completely neutralize wtAAV2. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Märsch, Stephan stephanmaersch@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-27965
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Kombinatorisch, Vektor, Optimierung, Selektion German combinatorial, vector, optimization, selection English
Date of oral exam:	1 July 2009
Referee:	Name Academic Title Mörsdorf, Dagmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2796