Beteiligung des Transmembranrezeptors CD5 und der durch miRNA modulierten Expression des Proto-Onkogens PLAG1 an der Pathogenese der Chronischen Lymphatischen Leukämie

Patz, Michaela (2009). Beteiligung des Transmembranrezeptors CD5 und der durch miRNA modulierten Expression des Proto-Onkogens PLAG1 an der Pathogenese der Chronischen Lymphatischen Leukämie. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) ist bis heute nicht heilbar. Für die Entwicklung neuer Therapieoptionen ist es wichtig, die Ursachen für das verstärkte Überleben der leukämischen B-Zellen zu verstehen. Der deregulierten Expression von Proteinen und RNA wird hierfür eine bedeutende Rolle zugeschrieben. In der vorliegenden Arbeit werden in diesem Zusammenhang die Proteine CD5 und PLAG1 betrachtet. Eine hohe Expression des Transmembranrezeptors CD5 ist charakteristisch für CLL-Zellen. Um den Einfluss von CD5-abhängigen Signalwegen in der CLL zu analysieren, wurde bislang der Rezeptor mit Hilfe von Antikörpern stimuliert. Jedoch können Antikörper unspezifische Reaktionen in der Zelle hervorrufen. Um dies zu vermeiden, wurde für die vorliegende Arbeit ein chimärer Rezeptor (CD5-EGFR) konstruiert und in die CLL-ähnliche Zelllinie Mec1 stabil transfiziert. Die Expression des chimären Rezeptors auf der Zelloberfläche und seine Dimerisierung nach Liganden-Zugabe konnte erfolgreich gezeigt werden. Der Nachweis einer liganden-spezifischen Aktivierung von CD5-spezifischen Signalkaskaden in diesem System gelang jedoch nicht. Ebenso zeigten Mec1-Klone, die CD5-EGFR oder CD5 stabil exprimieren, nach Stimulierung des chimären Rezeptors mit Ligand oder des nativen CD5-Rezeptors durch Anti-CD5 Antikörper kein verändertes Wachstum. An primären CLL-Zellen verbesserte dieselbe Behandlung mit Anti-CD5 Antikörpern im Durchschnitt die Viabilität. Auf Grund der stark unterschiedlichen Antworten der einzelnen CLL-Proben reagierten einige der untersuchten CLL-Klone, ähnlich den CD5-positiven Mec1-Zellen, nicht auf die Antikörper-vermittelte Stimulation. Eine Untersuchung konstitutiver Effekte der CD5-Expression war naheliegend, da an der cytoplasmatischen Domäne von CD5 eine Tyrosinphosphorylierung und eine Assoziation mit der Phosphatase SHP1 im Western Blot nachgewiesen wurde. Untersuchungen an den Zellinien Hek293, Jurkat und Mec1 zeigten, dass die ektopische Expression der cytoplasmatischen Domäne von CD5 die mRNA-Expression der Serin-Threonin Kinase PKCα herabsetzt. In fünf unabhängigen Mec1-Klonen verringerte die Expression der cytoplasmatischen Domäne von CD5 stets die metabolische Aktivität der Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass allein die Expression der cytoplasmatischen Domäne von CD5 ohne weitere Stimulation einen Einfluss auf Signalkaskaden, die Genexpression und die metabolische Aktivität hat, und damit zur Pathogenese der CLL beitragen kann. Die zweite in dieser Arbeit behandelte Fragestellung basiert auf miRNA-Array-Analysen, bei denen die Herabregulation einiger miRNAs in CLL-Zellen im Vergleich zu B-Zellen gesunder Probanden gefunden wurde. Durch bioinformatische Analysen der vorhergesagten Bindestellen dieser miRNAs, wurde die mRNA des Proto-Onkogens PLAG1 als potentielle Zielstruktur von deregulierten miRNAs in CLL-Zellen identifiziert. Durch die verringerte miRNA-Expression könnte die Proteinexpression von PLAG1 erhöht werden. Tatsächlich war das Expressionsniveau von PLAG1 in CLL-Zellen höher als in B-Lymphozyten gesunder Probanden. Durch Luziferase-Reporter-Assays konnte gezeigt werden, dass die identifizierten miRNAs an die vorhergesagten Bindestellen in der 3'UTR von PLAG1 mRNA binden und dadurch die Translation des Reportergens herabsetzen. Transfektion dieser miRNAs in primäre CLL-Zellen führte bei einigen CLL-Proben zu einem erhöhten Anteil apoptotischer Zellen. Diese Experimente legen nahe, dass eine Erhöhung der PLAG1-Expression mangels bestimmter miRNAs an der Pathogenese der CLL beteiligt sein könnte.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Involvement of the transmembrane receptor CD5 and the modulated expression of PLAG1 by miRNAs in the pathogenesis of Chronic Lymphocytic Leukemia	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Chronic Lymphatic Leukemia (CLL) is still an incurable disease. For the development of therapeutic options it is necessary to understand the reasons for the improved survival of leukemic B-cells. An important role is ascribed to the deregulated expression of proteins and RNA in CLL cells. In this context the proteins CD5 and PLAG1 were examined in the present work. High expression of the transmembrane receptor CD5 on B-cells is distinctive for CLL cells. For analysis of CD5-induced signaling pathways in CLL, so far the receptor has been stimulated by means of antibodies. Antibodies, however, may elicit unspecific effects on the cell. To avoid these effects a chimeric receptor (CD5-EGFR) was constructed and transfected into the CLL-like cell line Mec1. Expression of the chimeric construct on the cell surface and its dimerisation after addition of ligand were successfully demonstrated. The proof for ligand-specific activation of CD5-induced signaling cascades in this system, however, failed. Similarly, Mec1 clones stably expressing CD5-EGFR or CD5 did not show any changes in growth after stimulation with ligand or anti-CD5 antibodies. For primary CLL samples the same treatment with anti-CD5 antibodies on the average improved cell viability. Due to strongly different response of individual CLL samples, some of the investigated CLL clones, similarly to CD5-positive Mec1 cells, did not respond at all to antibody-mediated stimulation. It was obvious to investigate constitutive effects of CD5-expression, since tyrosine phosphorylation of the cytoplasmic domain of CD5 and its association with the phosphatase SHP1 was detected by Western Blot. Investigations of the cell lines Hek293, Jurkat and Mec1 showed that ectopic expression of the cytoplasmic domain of CD5 reduces the mRNA expression of the serine-threonine kinase PKCα. In five independent Mec1 clones expression of the cytoplasmic domain always decreased the metabolic activity of the cells. These results indicate that expression of the cytoplasmic domain of CD5, independently of its external stimulation can influence signaling cascades, gene expression and metabolic activity and thus contribute to the pathogenesis of CLL. The second topic of this thesis is based on miRNA-Array analysis, which showed down regulated miRNA expression in CLL cells as compared to peripheral B-cells of healthy donors. Bioinformatic analysis of the predicted binding sites for these miRNAs identified the mRNA of the proto-oncogene PLAG1 as a potential target of deregulated miRNAs in CLL cells. Reduced miRNA expression might increase the protein expression of PLAG1. Indeed, PLAG1 protein levels in CLL cells were higher than in B-lymphocytes from healthy donors. Luciferase-reporter-assays showed that miRNAs bind to the predicted binding sites in the 3'UTR of the PLAG1 mRNA and reduce translation of the reporter gene. Transfections of these miRNAs into CLL patient samples showed in some CLL samples resulted in an increased percentage of apoptotic cells. These experiments imply that an increased PLAG1 expression due to lack of certain miRNAs may be involved in the pathogenesis of CLL.

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