Molecular Genetic Characterization of Photoperiodic genes in Cassava (Manihot esculenta Crantz) and attempts to manipulate their expression to promote floral induction

Adeyemo, Sarah (2009). Molecular Genetic Characterization of Photoperiodic genes in Cassava (Manihot esculenta Crantz) and attempts to manipulate their expression to promote floral induction. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Flowering and its control is a critical developmental transition in angiosperms. The developmental timing of flowering has been widely studied in the temperate species Arabidopsis, which was well aided by the sequencing of its genome. However, the timing of flowering is not well understood in tropical species. Efforts are being made to extend the understanding of the molecular pathways controlling flowering from those of Arabidopsis to that of Cassava by taking advantage of genomics information from this temperate species. This should be an invaluable tool for understanding and exploiting floral timing in a tropical plant. Cassava is a crop that is critically important for food security in the tropics and sub-tropical regions of the world. Because, it is an orphan crop of limited research interest, almost nothing is known regarding its molecular basis of flowering. Therefore, it remains unclear what molecular pathways are implicated in flowering in Cassava and how this can be used to improve breeding. In this thesis, I provide insight to the discovery of photoperiod genes in Cassava and exploit this pathway to manipulate floral timing. Several genes of interest were sought for in this tropical plant, ranging from clock genes, to photoperiod genes, to the floral integrator, and finally, floral meristem-identity genes. Several genes were found and characterized. From there, transgenic approaches revealed that reproductive timing can be modified in Cassava. In Chapter 3, I identified and characterized three classes of photoperiod genes. The first gene isolated and characterized was MeGI, which revealed sequence similarity and conservation regions when compared with Arabidopsis. The comparison with GIGANTEA- related sequences from other species revealed by phylogeny that Cassava GI clearly clades with dicots and is more closely related in sequence to Castor bean GI. The MeGI expression was measured in Cassava and it was shown to track dusk. I found that MeGI peaks in expression at dusk under both long day or short day growth conditions. This is consistent with similar studies from other species. Another set of genes I found in Cassava was the CO-like genes, which I named MeCOL1, MeCO, and MeCOL2, respectively. The predicted protein encoded by MeCOL2 possesses two adjacent zinc-finger motifs, which is specific for genes in this family. COL2 was shown by phylogeny as the closest to the three MeCO-related genes. The expression of MeCO-like genes in Cassava showed they anticipated dawn. They were found to be acutely induced by light at dawn. Under short day growth conditions, they peaked two hours before dawn and this peak sharply increased at dawn under long days. This expression was decreased over the light period of the day. Thus, MeCOL genes have pre-dawn expression. Finally, I studied in genetic detail a Cassava orthologue of Arabidopsis ELF4. MeELF4 was found to complement elf4 by restoring circadian-rhythm defects of this Arabidopsis mutant. Therefore, I successfully characterized in Cassava the GI, members of the CO-like gene family, and the ELF4 orthologue, all of which are candidate genes for photoperiodic regulators. I bridged the gap between basic and applied research by exploiting the photoperiod- integrator gene FLOWERING LOCUS T (FT) as a tool in the manipulation of floral timing in Cassava. To generate this tool, I placed the Arabidopsis FT gene under the control of an ethanol-inducible promoter. I showed that the construct was functional, as it promoted flowering in a late-flowering genotype of Arabidopsis after ethanol application. This technology was then transferred to Cassava. I transformed a shy flowering Cassava genotype with Arabidopsis FT under the control of an ethanol-inducible promoter. FT expression was found to increase after spraying the Cassava transgenics with ethanol. These plants then flowered. This system is hoped to be applied in conventional breeding programs in order to be able to induce flowering at will, and thus make desired crosses that will lead to the improvement of the genetic basis of the crop.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Die Kontrolle des Blühzeitpunktes ist ein kritischer Entwickelungsschritt in Angiospermen. Das entwickelungsbiologische Timing des Blühzeitpunktes wurde, auch begünstigt durch die Sequenzierung ihres Genoms, weitgehend in Arabidopsis thaliana untersucht, einer Pflanze aus gemäßigten Zonen der Erde. Bei tropischen Arten hingegen ist die Kontrolle des Blühzeitpunktes noch wenig erforscht. Es wird daher versucht, das Verständnis der molekularen Signalwege, die das Blühen kontrollieren, ausgehend von Arabidopsis zu denen von Maniok (engl. Cassava; Manihot esculenta) zu erweitern, indem die Genominformationen aus Arabidopsis genutzt werden. Dies sollte ein wertvolles Werkzeug sein, um das Blühtiming einer tropischen Pflanze zu verstehen und entsprechend zu nutzen. Maniok ist eine Nutzpflanze, die für die Ernährungssicherheit in den Tropen und den subtropischen Regionen der Welt von entscheidender Bedeutung ist. Da es sich um eine vernachlässigte Ertragspflanze von begrenztem Forschungsinteresse handelt, ist fast nichts über die molekularen Grundlagen ihres Blühens bekannt. Daher sind die molekularen Signalwege, die eine Rolle beim Blühen von Maniok spielen, ebenso unklar wie die Frage, wie diese Signalwege zur züchterischen Verbesserung von Maniok genutzt werden könnten. Im Rahmen dieser Doktorarbeit gewähre ich Einblicke in die Entdeckung von Gene des photoperiode-abhängigen Blüh-Signalweges in Maniok und nutze Gene dieses Signalweges, um den Blühzeitpunkt zu manipulieren. Verschiedene Gene wurden gefunden und näher charakterisiert, darunter Gene der circadianen Uhr, des photoperiode-abhängigem Blüh-Signalweges, Blühzeitpunktgene und letztendlich Gene, die für die Identität des Blütenmeristems verantwortlich sind. Davon ausgehend konnte ich über transgene Pflanzen zeigen, dass der Blühzeitpunkt in Maniok modifiziert werden kann. In Kapitel 3 habe ich drei Klassen photoperiodischer Gene identifiziert und analysiert. Das erste isolierte und charakterisierte Gen war ein GIGANTEA Ortholog (MeGI), das eine hohe Sequenzähnlichkeit im Vergleich zu Arabidopsis zeigte. Der Vergleich mit GIGANTEA-Orthologen aus anderen Arten offenbarte durch Phylogenie, das MeGI eindeutlig dem Stamm der Dicotyledonen angehört und am engsten mit GI von Rizinus verwandt ist. Die MeGI Expression wurde in Maniok gemessen und es zeigte sich, dass die MeGI Expression sowohl unter Langtag- als auch unter Kurztag-Wachstumsbedingungen jeweils am Abend am höchsten ist. Dies stimmt mit ähnlichen Studien in anderen Organismen überein. Eine andere Gruppe von Genen, die ich in Maniok analysierte, waren die CONSTANS-ähnlichen Gene, die ich MeCOL1, MeCO und MeCOL2 nannte. Das vorhergesagte Protein von MeCOL2 besitzt zwei benachbarte Zink-Finger Motive, die spezifisch für Gene dieser Familie sind. Phylogenetische Untersuchungen zeigten, das COL2 den drei MeCO-verwandten Genen am nächsten steht. Die Expression von CO-ähnlichen Genen in Maniok zeigte, dass sie die Morgendämmerung antizipieren. (Es wurde festgestellt, dass sie durch Licht bei Tagesanbruch stark induziert werden). Unter Kurztagbedingungen erreichte die Expression den Höhepunkt zwei Stunden vor Tagesanfang, während das Expressionsmaximum unter Langtagbedingungen genau beim Tagesanfang lag. Diese Expression nahm während der Lichtperiode des Tages ab. Dies zeigt, dass MeCOL-Gene eine Expression vor Tagesanbruch haben. Schlussendlich studierte ich das Maniok Ortholog von Arabidopsis ELF4 im Detail. Es stellte sich heraus, dass MeELF4 die elf4-Mutation in Arabidopsis komplementiert und die circadianen Rhythmus-Defekte dieser Mutante beheben kann. Ich schloss die Lücke zwischen Basis- und angewandter Forschung, indem ich das photoperiodische Integratorgen FLOWERING LOCUS T (FT) als Werkzeug für die Manipulation des Blühzeitpunkts in Maniok nutzte. Um dieses Werkzeug zu erzeugen, setzte ich das Arabidopsis FT-Gen unter die Kontrolle eines Ethanol-induzierbaren Promoters. Ich zeigte die Funktionalität dieses Konstrukts, da es das Blühen in einem spät-blühenden Genotyp von Arabidopsis nach Ethanolbehandlung förderte. Diese Technologie wurde dann auf Maniok übertragen. Ich transformierte einen spät blühenden Genotyp von Maniok mit Arabidopsis FT unter der Kontrolle eines Ethanol-induzierbaren Promotors. Es wurde gezeigt, dass sich die FT-Expression nach dem Besprühen der transgenen Maniokpflanzen mit Ethanol erhöhte. Daraufhin begannen diese Pflanzen zu blühen. Es besteht die Hoffnung, dass dieses System in konventionellen Züchtungsprogrammen Anwendung finden wird, um den Beginn des Blühens zu einem gewünschten Zeitpunkt zu induzieren. Dies wird erwünschte Kreuzungen ermöglichen und somit dafür sorgen, dass die genetische Basis der Nutzpflanze Maniok weiter verbessert wird.

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