Molekulargenetische und funktionelle Analysen des LRP5-Gens bei einem Osteoporosis-Pseudoglioma-Syndrom-ähnlichen Phänotyp

Chung, Boidinh (2009). Molekulargenetische und funktionelle Analysen des LRP5-Gens bei einem Osteoporosis-Pseudoglioma-Syndrom-ähnlichen Phänotyp. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Durch positionelle Klonierung sollte das verantwortliche Gen für das in einer türkischen Familie vorliegende Fehlbildungssyndrom mit Augenfehlbildungen, einer progressiven Muskelatrophie und milden mentalen Retardierung identifiziert werden. Es wurde eine Compound-Heterozygotie für zwei neuartige Mutationen im Transmembranrezeptor LRP5 identifiziert, der als Co-Rezeptor in der WNT/NDP-Signalkaskade fungiert und auch beim autosomal-rezessiv erblichen Osteoporosis-Pseudoglioma-Syndrom mutiert ist. Die erste Mutation war eine heterozygote in-frame 18 bp-Deletion innerhalb eines für das LRP5-Signalpeptid kodierenden CTG-Repeats, wodurch 3 anstatt 9 Leucine im Signalpeptid des mutierten Allels (Mut3L) vorlagen. Die zweite Mutation war eine intragenische Deletion von ca. 8,2 kb. Diese führte auf mRNA-Ebene zu einer Deletion der Exons 14 bis 16 mit einem präterminalen Stop und folglich zu einem trunkierten Protein. Anhand unabhängiger funktioneller in vitro-Analysen wurde der zelluläre Pathomechanismus beider mutierter LRP5-Proteine aufgeklärt. Beide mutierten LRP5-Rezeptoren wurden stabil exprimiert, unterlagen allerdings einem aberranten intrazellulären Transport und konnten nicht in die Plasmamembran gelangen, um Signale entlang des WNT/NDP-Signalweges zu transduzieren. Die Signalpeptid-Mutation verhinderte den cotranslationalen Transport in das ER, so dass der Rezeptor ausschließlich im Cytoplasma lokalisiert war. Das OPPG-Syndrom untypische klinische Erscheinungsbild der Familie (Vorliegen einer muskulären Atrophie bei Abwesenheit einer stark ausgeprägten Osteoporose) lässt sich möglicherweise teilweise auf die neuartigen LRP5-Mutationstypen zurückführen. Im Rahmen der Genotypisierung gesunder Kontroll-Individuen bestätigte sich, dass der Leucin-Stretch des LRP5-Signalpeptides polymorph war, wobei 90% aller Allele 9 Leucine im Signalpeptid aufwiesen. Funktionelle Analysen der bei Kontroll-Individuen detektierten seltenen Signalpeptid-Varianten mit 6 bis 11 Leucinen ergaben, dass sowohl eine Verlängerung als auch eine Verkürzung des Signalpeptids dazu führten, dass weniger funktionsfähige Rezeptormoleküle gebildet wurden. Ursache war, dass jeweils ein steigender Anteil der Proteinsynthese nicht mehr im ER, sondern im Cytoplasma erfolgte. Ein Teil der LRP5-Moleküle konnte nicht in die Zellmembran gelangen. Damit konnte erstmals ein quantitativer Effekt eines hochvariablen Sequenzelementes im Signalpeptid eines Proteins auf die Effektivität der Proteintranslation experimentell demonstriert werden. Da genomweit durch eine bioinformatische Analyse fast 400 weitere humane Proteine identifiziert werden konnten, die Bereiche mit mindestens 5 Leucinen im Signalpeptid aufwiesen, könnte dieser Mechanismus eine nicht unbedeutende Ursache für die interindividuelle Variabilität der Proteintranslation und -expression darstellen und auch für die Genese komplexgenetischer Erkrankungen relevant sein. Ein weiterer Teil dieser Doktorarbeit bestand darin, den molekulargenetischen und zellulären Pathomechanismus bei einer zweiten konsanguinen türkischen Familie aufzuklären, in der zwei Betroffene ein typisches Osteoporosis-Pseudoglioma-Syndrom aufwiesen. Es konnte in dieser Familie eine pathogene homozygote LRP5-Mutation identifiziert werden, die innerhalb der Familie mit dem Phänotyp co-segregierte. In Kontroll-Individuen war diese nicht nachweisbar. Es handelte sich um einen homozygoten Basenaustausch an Position +4 der Donor Splice Site in Intron 7. Analysen an Patienten-RNA zeigten, dass infolge dieses Basenaustausches statt der ursprünglichen Splice Site eine 63 bp 3´-gelegene kryptische Splice Site verwendet wurde. Auf Proteinebene führte dies zu einer in frame-Insertion von 21 zusätzlichen Aminosäuren. Funktionelle in vitro-Analysen dieses mutierten LRP5-Proteins ergaben, dass es einem aberranten intrazellulärem Transport unterlag und folglich nicht mehr in der Lage war, Signale entlang der WNT/NDP-Signalkaskade zu transduzieren. Da im humanen Genom ein exprimiertes und prozessiertes Pseudogen für LRP5 annotiert ist, wurde experimentell überprüft, ob LRP5 durch einen auf RNA-Interferenz beruhenden Mechanismus vom seinem LRP5L-Pseudogen reguliert wird. Die bislang unbekannte Struktur, Größe und Orientierung des LRP5L-Transkriptes wurde mit Hilfe von Datenbank-Analysen und RACE-PCR-Experimenten aufgeklärt. Das LRP5L-Pseudogen besteht aus sieben Exons, die insgesamt 1740 bp umfassen. Der größte offene Leserahmen beträgt 756 bp. Mittels Expressiopnsanalysen wurde gezeigt, das LRP5L in den Geweben Herz, Lunge, Niere, Dünndarm, Colon, Milz, Thymus, Leukozyten und Pankreas unterschiedlich relativ stark exprimiert wird. Die Hypothese einer trans-Regulation von LRP5 durch sein Pseudogen konnte weder mit Hilfe eines Luciferase Reporter Assays (Co-Transfektion von Expressionskonstrukten für LRP5L und LRP5) noch durch RNAi-Analysen (Zellinien mit endogener LRP5L- und LRP5- Expression) in vitro bestätigt werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Moleculargenetic and functional analysis of the LRP5 gene in a Osteoporosis-Pseudoglioma Syndrome like phenotype	English

Translated abstract:

Abstract

Language

For identification of the gene responsible for the combination of blindness, progessive muscle atrophy and mild mental retardation observed in a Turkish family, a positional cloning approach was carried out. Compound heterozygosity for two novel types of mutation were detected in the transmembrane receptor LRP5, a co-receptor of the WNT/NDP signaling cascade. Mutations in LRP5 underlie autosomal recessive osteoporosis pseudoglioma syndrome (OPPG). One mutation was an in-frame deletion of 18 bp within the signal peptide coding for a CTG-repeat, which removed 6 out of 9 consecutive leucine residues of the LRP5 signal peptide (Mut3L). The second mutation due to nonhomologous recombination between Alu repeat sequences resulted in the deletion of exons 14 to 16. This presumably leads to the production of a nonfunctional, truncated, and frameshifted polypeptide, if expressed. Different independent functional in vitro assays resulted in the elucidation of the underlying pathomechanisms for both mutations. The mutant proteins were stably expressed but underwent aberrant intracellular transport. This impaired the ability of WNT/NDP signal transduction for both mutant receptors due to not reaching the plasmamembrane. The signal peptide mutation abolished the entry of the polypeptide into the endoplasmic reticulum (ER), therefore retaining the mutant protein in the cytoplasm. The uncharacteristic features for OPPG, notably muscular atrophy without severe osteoporosis, may be attributable to the novel types of mutation. Genotyping of control individuals confirmed that the length of the LRP5 signal peptide poly-leucine repeat is polymorphic in the general population and 90% of the detected alleles contained 9 leucines. Importantly, independent in vitro assays demonstrated that enlargement or reduction of the 9 leucine stretch quantitatively affected receptor processing and signal transduction. This was due to partial retention of the proteins in the cytoplasm and resulted in a decreased amount of functional receptor in the plasma membrane. Therefore, it could be for the first time experimentally demonstrated that variability of a signal peptide element has a quantitative effect on protein translation efficiency. Due to identification through a genome-wide search of nearly 400 human proteins that contain at least five consecutive leucine repeats within their signal peptide, this polymorphism may be physiologically relevant in vivo. It possibly constitutes a source of interindividual variability of protein translation and expression which might be relevant for complex diseases. A further part of this PhD thesis included the clarification of the molecular and cellular pathomechanism of a second Turkish family affected by typical OPPG syndrome. One new pathogenic homozygous mutation in LRP5 was identified that co-segregated perfectly with the phenotype among the family and was absent in control individuals. This mutation was a single base substitution at position +4 of the donor splice site in intron 7. Analysis of patient's RNA showed that this change leads to a preference of a 63 bp 3'-located cryptic splice site instead of the original splice site resulting in a in frame insertion of 21 amino acids. Functional in vitro analysis of this mutant receptor demonstrated an impaired intracellular transport of the protein which abolished signal transduction through the WNT/NDP signaling pathway. Due to the occurrence of an expressed and processed pseudogene (LRP5L) of LRP5 annotated in the human genome, RNA interference (RNAi)-experiments were performed to investigate a presumable regulatory effect of LRP5L on LRP5. Based on in silico and RACE analysis the yet unknown pseudogene structure, size and transcript orientation were elucidated. LRP5L consists of 7 exons with 1740 bp in size and a biggest open reading frame of 756 bp. Expression analysis showed different expression levels of LRP5L in 9 out of 12 examined human cDNAs, namely heart, lung, kidney, small intestine, colon, spleen, thymus, leucocytes and pancreas. Neither a luciferase reporter assay (with co-transfection of vectors coding for LRP5L and LRP5 cDNA) nor RNAi analysis (in cell lines with endogenous LRP5L and LRP5 expression) confirmed the hypothesis of trans-regulation of LRP5 by its pseudogene LRP5L.

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