Nesprine: Makromolekulare Bindeglieder zwischen Kernhülle und Zytoskelett

Schneider, Maria (2009). Nesprine: Makromolekulare Bindeglieder zwischen Kernhülle und Zytoskelett. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die in Vertebraten identifizierten Nesprine sind spezifische Gerüstproteine der Kernmembran, die zu den Mitgliedern der KASH- sowie Spektrin-Familie zählen. Evolutionär konservierte KASH-Proteine fungieren als einzigartige Bindeglieder, die den Zellkern in das angrenzende bzw. umlagernde Zytoskelett integrieren, um somit die Positionierung des Nukleus zu vermitteln. Obwohl die nukleäre Positionierung für eine Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellbewegung, Zellpolarität, Zellteilung und Entwicklung eines Gewebes von entscheidender Funktion ist, ist dieser Mechanismus bislang jedoch nur wenig erforscht. Diese Studie liefert neue Hinweise, dass Nesprinen aufgrund von Assoziationen mit den molekularen Motorprotein Dynein/Dynactin sowie Kinesin 1 eine neue funktionelle Bedeutung an der Kernhülle zukommt. Die Basis dafür haben Hefe-Zwei-Hybrid Durchmusterungen gebildet, mit denen p150 Glued und die leichten Ketten des Kinesin 1 (KLC1) als neue Bindepartner für Nesprin-1 bzw. Nesprin-2 identifiziert werden konnten. Diese Interaktionen wurden in vitro sowie in vivo durch vielfältige biochemische und zellbiologische Methoden validiert. Darüber hinaus kann die Existenz zweier verschiedener subzellulärer Nesprin-2 Pools vermutet werden, die sich funktionell voneinander unterscheiden. Die an der äußeren Kernmembran verankerten Nesprin-2 KASH-Isoformen erlauben die spezifische Bindung des KLC1 an der Kernhülle. KLC1 bildet mittels der schweren Kette des Kinesin 1 einen aktiven Mikrotubuli-Motorkomplex, der ein ausgeprägtes Mikrotubulinetzwerk rund um den Nukleus organisiert. Des Weiteren weist dieser Kernhüllen-assoziierte Pool auf das Vorhandensein eines aus C-terminalen Nesprin-2 Isoformen und SUN2 Proteinen bestehenden makromolekularen Komplexes hin, der über KLC1 mit zentrosomalen Proteinen wie dem Rootletin assoziiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Interaktion für die Anbindung des Zentrosoms an die Kernhülle erforderlich ist, da die Abwesenheit des Nesprin-2 sowie des KLC1 zu einer vergrößerten zentrosomalen Distanz zum Nukleus sowie zu einer defekten Zellpolarität führt. Ein zweiter Pool, der C-terminale KASH-defiziente Nesprin-2 Isoformen umfasst, lokalisiert am Zentrosom und beeinflusst aufgrund der KLC1-Rootletin Assoziation die zentrosomale Kohäsion. Dieser zentrosomale Phänotyp ist auf Nesprin-2 knock out und KLC1 knock down Studien zurückzuführen, in denen eine erhöhte Zentrosomenanzahl nachgewiesen werden konnte. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass die Nesprin-2 Proteine in eine Vielzahl von essentiellen zellulären Prozessen involviert sind. Zudem beeinträchtigt die Verdrängung der Kernhüllen-assoziierten Nesprine die Positionierung der Mitochondrien wie auch den TGF-β Signalweg. Zusammenfassend zeigt sich, dass die äußere Kernmembran, ähnlich wie die innere Kernmembran, zu einer spezialisierten strukturellen Phasengrenzfläche organisiert ist. Daneben ist ersichtlich, dass die zentrosomale Biologie durch die Abwesenheit des Nesprin-2 verändert wird, wobei diese Veränderungen neue Einblicke in die Pathogenese von humanen degenerativen Erkrankungen erlauben.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Title	Language
Nesprine: Makromolekulare Bindeglieder zwischen Kernhülle und Zytoskelett	German

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Abstract

Language

Nesprins are specific nuclear membrane scaffolding proteins that are members of the KASH- and spectrin-family in mammalian cells. Throughout evolution KASH-proteins function as specific tethering devices that integrate the nucleus with the surrounding cytoskeleton to warrant nuclear positioning. While nuclear positioning is a vital process, which governs a wide variety of cellular processes like cell motility, cell polarity, cell division and tissue morphogenesis, it still remains a poorly understood mechanism. The current study provides evidence that Nesprins mediate important associations with the Dynein/Dynactin and Kinesin 1 based motor protein apparatus and shed insights into nuclear envelope affiliated functions. Using the yeast-two-hybrid screen the p150 Glued and Kinesin light chain 1 (KLC1) proteins are identified as Nesprin-1 and Nesprin-2 binding partners, respectively. These interactions are validated both in vivo and in vitro using a wide variety of biochemical and cell biological techniques. In addition, evidence is provided which favors the existence of two functionally distinct Nesprin-2 isoform pools. Outer nuclear membrane (ONM) Nesprin-2 KASH-domain isoforms tether KLC1 specifically at the nuclear envelope (NE). The latter associates with Kinesin heavy chain and facilitates the distinct organization of the microtubule network around the nuclear surface. Furthermore, the existence of specific Nesprin-2 C-terminal isoform and SUN2 protein macromolecular assemblies is demonstrated that associate through KLC1 with centrosomal structural proteins such as Rootletin. We show that these associations are required for centrosomal tethering to the NE and when absent result in defective cell polarity. A second pool of Nesprin-2 C-terminal KASH-deficient isoforms resides at the centrosome itself where it interacts with KLC1 and Rootletin to warrant centrosome cohesion. Intriguingly, the Nesprin-2 knock out and KLC1 silencing resulted in increased centrosomal numbers in mutant cells. These results suggest multiple and important functions for the Nesprin-2 proteins. Such thoughts are in agreement with our findings that Nesprins function in mitochondrial positioning and the TGF-β signaling pathway. Collectively these data indicate that the ONM, similar to the inner nuclear membrane is organized as a specific structural interface. More importantly, the fact that major aspects of the centrosomal biology are affected in Nesprin-2 mutant cells paves the way to explore novel mechanisms in degenerative human diseases.

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