Die Funktion der viralen Phospholipase A2 während der Infektion des Adeno-assoziierten Virus 2

Stahnke, Stefanie (2008). Die Funktion der viralen Phospholipase A2 während der Infektion des Adeno-assoziierten Virus 2. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
Veroeffentlichung_Final__Promotionsarbeit_081208.pdf
Download (1MB)

Abstract

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV), ein Vertreter der Parvoviridae, wurde zu einem sehr erfolgreichen Vektorsystem entwickelt. Einen wichtigen Beitrag hierzu hat die Verfügbarkeit der verschiedenen Serotypen geleistet. Zwei dieser Serotypen, AAV2 und AAV8, wurden in dieser Arbeit näher untersucht. Beide Serotypen akkumulieren nach intravenöser Gabe in der Leber, aber nur AAV8 vermittelt eine effiziente Transgenexpression. In meiner Arbeit konnte ich deutlich zeigen, dass AAV2 im Gegensatz zu AAV8 in Hepatozyten einen intrazellulären Block erfährt. So wurde AAV2 zwar signifikant effizienter als AAV8 in humane (HepG2) und murine (H2.35) Hepatozyten aufgenommen, aber im Vergleich zu AAV8 waren deutlich mehr intrazelluläre AAV2-Partikel nötig, um in Hepatozyten eine Genexpression zu erreichen. Die Identifizierung des limitierenden Schritts könnte durch die Visualisierung der Transduktion erleichtert werden. Bis zu meiner Arbeit waren mikroskopische Analysen für AAV8 jedoch nicht möglich, da keine Antikörper zur Verfügung stehen. Um diese Limitation zu überwinden, markierte ich das AAV-Kapsid genetisch mit Fluoreszenzproteinen. Hierzu verwendete ich GFP, CFP, DsRed und mCherry, die ich genetisch an den N-Terminus des VP2 fusionierte. Bei der Vektorherstellung werden die Fusionsproteine dann in das Kapsid eingebaut. Die Vektorpräparationen wiesen genomische Titer auf, die mit denen von nicht-markierten Viren vergleichbar waren und konnten erfolgreich zur Visualisierung verwendet werden. Durch diese technische Entwicklung können - wie hier gezeigt - nun auch Ko-Transduktionen mit genetisch-markierten AAV2 und AAV8 Vektoren durchgeführt werden. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte ich die Rolle der Phospholipase A2 (PLA2)-Domäne, die sich in der unique region des VP1 befindet, aufklären. Eine Mutation im katalytischen Zentrum der PLA2 führt zu einer signifikanten Abnahme des infektiösen Titers (Girod et al., 2002). Diese Abnahme begründet sich nicht in einer ineffizienten zellulären Aufnahme, wie ich durch quantitative Bestimmung der intrazellulären Partikel zeigen konnte. Auch werden sowohl die Mutante als auch das AAV2 effizient in die perinukleäre Region transportiert. Da der intrazelluläre Transport von AAV innerhalb von Endosomen erfolgt und späte Endosomen in der perinuklären Region zu detektieren sind, könnte die Phospholipaseaktivität an der Freisetzung der viralen Partikel aus den Endosomen und/oder am Kerneintritt beteiligt sein. Meine Ergebnisse sprachen gegen letztere Hypothese. Dagegen konnte ich zeigen, dass die Inhibierung des proteasomalen Abbaus sowie wie Verwendung der endoosmolytischen Aktivität des Adenovirus die Transduktionseffizienz der Mutante deutlich steigerte. Daraus lässt sich ableiten, dass die Mutante innerhalb von Endosomen zurückgehalten wird und dass die PLA2 Aktivität für die Freisetzung von AAV aus den Endosomen benötigt wird.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
The function of the viral phospholipase A2 in adeno-associated virus 2 infection	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Adeno-associated virus (AAV), a member of the parvovirus family, has gained increasing attention as vector platform due to the availability of a number of different serotype which differ in their tropism. Two of these serotypes, AAV2 and AAV8, are of interest for this work. Both serotypes accumulate in liver following intravenous injection into mice, but only AAV8 elicits a successful gene expression. Within this work, I provided evidence that AAV2 mediated gene transfer into hepatocytes - in contrast to AAV8 - is limited at a post entry step. AAV2 was superior to AAV8 in cell entry into a human (HepG2) and a murine (H2.35) hepatocyte cell line, but in comparison to AAV8 significant fewer intracellular particles of AAV2 successfully contributed to vector genome expression. To investigate the AAV hepatocyte cell interaction in more detail, visualization of the infection process ought to be auxiliary. However, up to my work, imaging studies could not be performed with AAV8 since anti-AAV8 antibodies were lacking. I circumvented this limitation by genetic-labelling of the viral capsid. Briefly, the fluorescent proteins GFP, CFP, DsRed and mCherry, respectively, were fused to the N-terminus of VP2, the second largest of the AAV capsid proteins, and incorporated as fusion protein into the AAV capsid during vector packaging. Viral vector preparation of genetically labelled AAV particles were produced to titers comparable to AAV with unmodified capsids, and viral preparation were used successfully for imaging studies. Due to this development co-infection studies of genetically labelled AAV2 and AAV8 can now be performed as shown here in proof-of-principle experiments. The second part of my work allows to clarify the role of the secretory phospholipase A2 (sPLA2) domain located in the unique region of the largest AAV capsid protein (VP1) in AAV2 infection biology. A mutation in the catalytic center of the PLA2 motiv causes a dramatic drop in infectivity (Girod et al., 2002) which is not due to impaired cell entry as shown by qPCR analysis of intracellular vector genomes. Both vectors, AAV2 with unmodified capsid and the mutant, were also efficiently transported towards the perinuclear area. Since AAV is transported within endosomes and late endosomes are located in the perinuclear area, phospholipase activity could be involved in endosomal escape and/or nuclear entry. For the latter hypothesis no evidence could be provided. In contrast, mutant could be rescued by inhibiting proteasomal degradation and by applying the endoosmolytic activity of adenovirus revealing that the mutant is trapped within this compartment and that PLA2 activity permits endosomal escape.

English

Creators: