Universität zu Köln

Khan, Muhammad Ramzan (2009). Molecular evolution of the inflated calyx syndrome in Withania (Solanaceae). PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Diese Arbeit befasst sich mit der molekularen Grundlage der Evolution morphologischer Neuheiten in Solanaceen, mit dem Ziel, zum Verständnis der Subfunktionalisierung bzw. der Neofunktionalisierung der beteiligten Gene beizutragen. Frühere Studien verließen sich hinsichtlich ihrer Methodik größtenteils auf DNA-Sequenz-Analysen, entbehrten aber der funktionellen Untersuchung duplizierter Gene, was oft zu widersprüchlichen Ergebnissen führte. In dieser Arbeit wurden bioinformatische und experimentelle Herangehensweisen vereint, um die Fragen von Duplikation, Sub- und bzw. oder Neofunktionalisierung, Selektion und Diversifizierung von Genen zu untersuchen, die der - in den Withaninae vorherrschenden - evolutionären Neuerung des Inflated Calyx Syndroms (ICS) zu Grunde liegen. In der Gattung Withania, ebenso wie in Physalis, nehmen die Sepalen nach der Bestäubung das Wachstum wieder auf und hüllen schließlich die reife Frucht vollständig in einer Ballon-ähnlichen Struktur ein, was als Inflated-Calyx-Syndrom (ICS) bezeichnet wird. Während Withania-Arten eine Vielfalt an aufgeblähten Calyces aufweisen, besitzt Tubocapsicum - eine nahe verwandte Gattung - lediglich einen rudimentären Kelch. Pflanzenhormone - wie Cytokinine und Gibberelline - können die Befruchtungssignale imitieren und sind unerlässlich für die ICS-Ausprägung in Withania. In der diploiden Art Physalis floridana ist ein einzelnes Gen � das MADS-Box-Gen MPF2 � zusätzlich zur ICS-Ausprägung für Blattentwicklung und männliche Fertilität verantwortlich. Dagegen bietet sich in Withania, einer laut Ploidie-Untersuchung offenbar tetraploiden Gattung, die Möglichkeit, diese Funktionen von einander getrennt zu untersuchen. Zwei Klassen von MPF2-Orthologen � MPF2-like-A (z.B. WSA206) und MPF2-like-B (z.B. WSB206) � wurden aus Withania isoliert, jedoch nur eine Klasse � MPF2-like-B (TAB201) � aus Tubocapsicum, da MPF2-like-A-Gene im Genom dieser Art nicht vorhanden sind. Trotz ähnlicher Gen-Struktur besitzen MPF2-like-A Proteine mit einer 3 Aminosäuren umfassenden Deletion in ihrer C-terminalen Domäne und dem Vorhandensein von 8 zusätzlichen Aminosäuren am C-terminalen Ende im Vergleich zu MPF2 von Physalis einen ungewöhnlichen Aufbau. Nichtsdestotrotz scheinen sie phylogenetisch näher mit MPF2 verwandt zu sein als die MPF2-like-B-Gruppe. Positive Darwinsche Selektion wurde in den phylogenetischen Ästen, die zu Physalis MPF2-like und Withania MPF2-like-A-Proteinen führen, detektiert. Im Gegensatz dazu waren sowohl MPF2-like-Proteine von Arten, die kein ICS aufweisen, als auch alle MPF2-like-B-Proteine unter negativer (reinigender) Selektion. Während MPF2-like-B-Protein-Überexpression in Arabidopsis-Pflanzen keine phänotypischen Abweichungen im Vergleich zum Wildtyp hervorrief, traten bei MPF2-like-A-Protein-Überexpression stark vergrößerte Sepalen und Abweichungen in Form und Anzahl der Früchte auf, was darauf hindeutet, dass die Funktion beider Proteine unterschiedlich ist. Dies wird durch ihre divergenten Expressionsmuster gestützt. Während MPF2-like-A-Gene in Withania zusätzlich zu vegetativen auch in floralen Geweben exprimiert werden und somit eine Korrelation zur ICS-Bildung aufweisen, ist die Expression von MPF-2like-B-Genen auf vegetative Gewebe beschränkt. Dies verhält sich anders in Tubocapsicum, wo MPF2-like-B-Gen-Expression in allen untersuchten Geweben gefunden werden konnte, jedoch kein ICS ausgeprägt wird. Bioinformatische Analysen der Sequenzen von Promotoren und ersten Introns dieser Gene zeigten das Vorhandensein einer konservierten CArG-Box - putatives Bindemotif für AG, SEP1, SEP4, AGL1, and AGL15 - nahe dem Transkriptionsstart in allen hier untersuchten MPF2-like-Genen, außer in MPF2-like-B-Genen in Withania. Dahingegen treten Auxin-Response-Elemente (AuxREs), die in einer 100 Basenpaare umfassenden hoch-konservierten Region im 1. Intron von MPF2-like-B-Genen identifiziert wurden, nicht in MPF2-like-A-Genen auf. Sowohl MPF2-like-A- als auch MPF2-like-B-Gen-Promotoren riefen starke GUS-Expression in den Blüten transgener Arabidopsis-Pflanzen hervor. Dagegen unterdrückten Sequenzen des ersten Introns generell die Reportergen-Expression (GUS und YFP) in Blättern von Arabidopsis bzw. in transient transformierten Blättern von Nicotiana benthamiana. Nur MPF2-like-A Proteine sind in der Lage, im Yeast-2-Hybrid-System Homodimere zu bilden. Das Repressor-Motiv am C-Terminus der MPF2-like-A-Proteine ist in Autoaktivierung involviert. Durchmustern einer Arabidopsis-oligo-dT-Hefe-Library mit diesen Proteinen führte zur Identifizierung zahlreicher MADS- und Nicht-MADS-Domänen-Proteine als putative Interaktionspartner. Die Interaktion von MPF2-like-A-Proteinen mit Arabidopsis-Proteinen, die an der Regulation der Blütenentwicklung beteiligt sind (z.B. SOC1, AGL27, AGL19, AGL31, AGL42, AGL68, MAF4, SEP3, SEP4), und die ausschließliche Interaktion von Wihania MPF2-like-B-Proteinen mit Nicht-MADS-Domänen-Proteinen, (z.B. IAA16, EMB1417, ATSIP, AKIN, MYB4), unterstützt eine funktionelle Divergenz der Proteine und korreliert mit ihren divergenten Expressionsmustern. Tubocapsisum MPF2-like-B-Proteine dagegen sind in der Lage mit SOC1, AGL27 und MAF5 zu interagieren, was auf eine intermediäre Funktionalität zwischen den beiden Gruppen von Withania MPF2-like-Proteinen hinweist. Withania MPF2-like-B-Proteine können mit MAGO NASHI-Homologen von Withania, Tubocapsicum und Physalis interagieren. MAGO NASHI ist ein hoch-konserviertes Protein, das an diversen Entwicklungsprozessen, zum Beispiel Keimzell-Differenzierung, beteiligt ist. Anders als Withania MPF2-like-B-Proteine können MPF2-like-A-Proteine mit keinem dieser MAGO NASHI-Proteine von Solanaceen (WSMAGO1, WSMAGO2, TAMAGO1, TAMAGO2, PFMAGO1, PFMAGO2) interagieren, doch die Fähigkeit von Tubocapsicum MPF2-like-B Proteinen, einige dieser MAGO NASHI-Homologe zu binden, weist erneut auf ihren intermediären Charakter zwischen Withania-MPF2-like-Proteinen hin. Eindeutig sind MPF2-like-A-Gene in die ICS-Ausprägung involviert, die Funktion von MPF2-like-B-Genen � abgesehen von einer möglichen Rolle in der Blattentwicklung - bleibt jedoch ungewiss. Allotetraploidisierung trug wesentlich zur Subfunktionalisierung der MPF2-like-Gene und positive Darwinsche Selektion ist von großer Bedeutung für die evolutionären Geschichte der Physaleae. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Auswirkungen von Genduplikationen auf die Anpassung und Anpassungsfähigkeit von Organismen und demonstrieren die Leistungsfähigkeit von Studien in evolutionärer Entwicklungsgenetik, die Sequenz-Analyse und funktionellen Untersuchungen kombinieren. Die hier beschriebenen Ergebnisse sind nicht nur essentielle Grundlage für das Verstehen, wie die evolutionäre Calyx-Neuerung in den Withaninae entstand und erhalten wurde, sondern geben auch ein elegantes Beispiel dafür, wie wilde �evolutionäre Mutanten� zur Aufschlüsselung komplexer Merkmale genutzt werden können.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language This thesis concerns the molecular basis of the evolution of morphological novelties in Solanaceae. The aim is to contribute to understanding the sub-functionalization and/or neo-functionalization of genes involved. The methodology of earlier studies relied largely on DNA sequence analysis but lacked functional analyses of duplicated genes, frequently generating ambiguous results. In this study an amalgamation of both computational and experimental approaches has been employed to address the questions related to duplication, sub- and/or neo-functionalization, selection and diversification of genes underlying the evolutionary morphological novelty of the Inflated Calyx Syndrome (ICS) prevailing in the Withaninae. In the genus Withania, like in Physalis, the sepals resume growth after pollination to encapsulate the mature fruit, forming a balloon-like structure termed ICS. While Withania species display a diversity of inflated calyces, Tubocapsicum, a close relative, has only a rudimentary calyx. Plant hormones such as cytokinin and gibberellin can mimic the fertilization signals and are essential for ICS formation in Withania. In the diploid species Physalis floridana, a unique gene MPF2 belonging to the MADS-box gene family, in addition to controlling ICS formation, is responsible for leaf development as well as male fertility. However, Withania being a tetraploid, as evident from ploidy evaluation, offers the possibility to sort out these functions. Two classes of MPF2-like orthologs, MPF2-like-A (i.e. WSA206) and MPF2-like-B (i.e. WSB206), were isolated from Withania, but only one class from Tubocapsicum, MPF2-like-B (TAB201), since an MPF2-like-A gene does not exist in the genome. Although their gene structures are similar, MPF2-like-A proteins have an aberrant structure with respect to MPF2 of Physalis. MPF2-like-A proteins feature a 3aa deletion in their C-terminal region and an 8 aa addition at their C-terminus. Nonetheless, they seem to be phylogenetically closer related to MPF2 than the MPF2-like-B proteins. Positive Darwinian selection was observed in the branch leading to Physalis MPF2-like and Withania MPF2-like-A proteins. MPF2-like proteins of non-ICS forming species as well as all MPF2-like-B proteins were under purifying selection. Over-expression of an MPF2-like-B gene (WSB206) in Arabidopsis did not demonstrate a phenotype deviating from wild type, but MPF2-like-A (WSA206) caused enormous enlargement of sepals and alterations in the number as well as the morphology of fruits indicating that the functions of the two proteins are different. This is supported by their divergent expression patterns. In Withania the MPF2-like-A gene is expressed in vegetative and in flower tissues and thus correlates with ICS formation, while the expression of MPF2-like-B gene is restricted to vegetative tissues only. This is different in Tubocapsicum where the MPF2-like-B gene is expressed in all tissues tested but ICS formation is impaired. Bioinformatic analyses of promoter and first intron sequences of MPF2-like genes have revealed that a conserved CArG-box - putative binding site for AG, SEP1, SEP4, AGL1, AGL15 - close to the transcription initiation site is present in all the MPF2-like promoters except MPF2-like-B of Withania (WSB206), while auxin response elements (AuxREs) are not present in MPF2-like-A, but found in all the MPF2-like-B genes in a 100 base pair highly conserved region at different positions in the first introns. Promoters of both the MPF2-like-A and MPF2-like-B genes drive strong GUS expression in transgenic Arabidopsis flowers, although MPF2-like-B (WSB206) is not expressed in the flower natively. Remarkably, the first introns generally suppress the activation of reporter gene (GUS and YFP) expression both in stable Arabidopsis transformants and transient assay of N. benthamiana leaves. Only MPF2-like-A proteins have the ability to form homodimers in yeast two-hybrid analysis. The repressor motif (R-motif) at the C-terminus of MPF2-like-A proteins is involved in the self-activation. Arabidopsis oligo-dT yeast library screening with these proteins yielded numerous non-MADS and MADS-domain interactors. The interactions of MPF2-like-A proteins with Arabidopsis proteins involved in regulating the flowering time (e.g. SOC1, AGL27, AGL19, AGL31, AGL42, AGL68, MAF4, SEP3 and SEP4), and of MPF2-like-B proteins of Withania exclusively with non-MADS-domain proteins (e.g. IAA16, EMB1417, ATSIP, AKIN and MYB4) support their functional divergence and coincide with their different expression patterns. Tubocapsicum MPF2-like-B (TAB201) proteins can interact with SOC1, AGL27, and MAF5 indicating their intermediate role between Withania MPF2-like (WSA206 and WSB206) proteins. However, Withania MPF2-like-B proteins can interact with MAGO NASHI homologs of Withania, Tubocapsicum and Physalis. The gene mago nashi is a highly conserved protein known to be involved in many developmental processes including germ cells differentiation. Withania MPF2-like-A cannot interact with Solanacaeous MAGO NASHI-like proteins (WSMAGO1, WSMAGO2, TAMAGO1, TAMAGO2, PFMAGO1, PFMAGO2) but the ability of Tubocapsicum MPF2-like-B proteins to show affinities for some of the MAGO NASHI-like proteins further support their intermediate role between Withania MPF2-like proteins. Unequivocally MPF2-like-A genes are involved in ICS. Apart from their putative role in leaf development, the function of MPF2-like-B genes remains obscure. The contribution of allo-tetraploidization to sub- and/or neo-functionalization of MPF2-like genes are discussed, as is the positive Darwinian selection in the evolution of the Physaleae. These findings demonstrate the contribution of gene duplication to organismal adaptability and show the power of combining sequence analyses and functional assays in delineating the molecular basis of morphological novelties. The findings reported here are therefore not only of fundamental significance in explaining how the calyx novelty evolved and was maintained in Physaleae, but also provide a nice example of using wild �evolutionary mutants� to dissect complex trait variations. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Khan, Muhammad Ramzan khan@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-28765
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language ICS , MADS-box , evolution , Subfunctionalization , Withania English
Date of oral exam:	20 April 2009
Referee:	Name Academic Title Saedler, Heinz Prof. Dr
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2876