Universität zu Köln

Wirtz, Dörthe Hendrike (2009). Strukturbasierte Entwicklung von Kinaseinhibitoren. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Diss.wirtz.pdf Download (6MB)

Abstract

Der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-1 Rezeptor (IGF-1R) und der Insulinrezeptor (IR) sind Mitglieder der transmembranständigen Rezeptortyrosinkinasen, die zur Überfamilie der Wachstumsfaktorrezeptoren gehören. IGF-1R ist verantwortlich für die Entwicklung, normales Wachstum und Differenzierung der Zelle aber auch die Unterdrückung der Apoptose. Die Fähigkeit des Rezeptors, gleichzeitig proliferative und anti-apoptotische Signale zu initiieren, macht ihn zu einem möglichen Target für die Entwicklung von Inhibitoren als Krebs-Therapeutika. Die gängigen Kinaseinhibitoren sind niedermolekulare, ATP-kompetitive Inhibitoren. Da die ATP-Bindestelle unter Kinasen hoch konserviert ist, weisen solche Inhibitoren meist geringe Spezifität auf, was zu starken Nebenwirkungen führen kann. Besonders beim IGF-1R ist eine spezifische Inhibition essentiell. Eine gleichzeitige Hemmung des nah verwandten IR kann fatale Konsequenzen haben, wie zum Beispiel die Ausbildung eines diabetischen Phänotyps. Um dies zu umgehen, war es das Ziel dieser Arbeit, einen spezifischen, peptidischen Inhibitor für die Kinase des IGF-1R zu entwickeln. Nach übereinstimmender Meinung werden Rezeptortyrosinkinasen über Dimerisierung aktiviert. Daher basierte mein Ansatz zur Inhibition des IGF-R auf der Unterbindung der Dimerisierung über Kompetition mit sequenzspezifischen Peptiden. Realisiert wurde dieses Konzept an zwei Bereichen des IGF-1R: Einmal der Juxtamembranbereich, in dem neben einer autoregulatorischen Region auch eine Dimerisierungsdomäne lokalisiert ist. Zudem unterscheiden sich IR und IGF-1R in dieser Region deutlich in ihrer Sequenz. Zum anderen die alpha-D-Helix/hinge region, die maßgeblich den Konformationsübergang zwischen inaktiver und aktiver Kinasestruktur bestimmt und an der Dimerisierung der Kinase und der Substraterkennung beteiligt ist. Mittels Phage Display wurden aus einer nahezu unbeschränkten Anzahl an verschiedenen Peptiden mit randomerisierter Sequenz diejenigen selektioniert, die spezifisch an die entsprechenden Bereiche, Juxtamembranbereich und alpha-D-Helix/hinge region, banden. Um die aus dem Phage Display erhaltenen Peptidsequenzen zu generieren, wurde eine Technik entwickelt, kleine Peptide in E.coli im großen Maßstab zu expremieren und über Affinitätschromatographie zu reinigen. Die Validierung der gefundenen Sequenzen gegen die Juxtamembrandomäne lieferte eine Peptidsequenz, die im mikromolaren Bereich fähig ist, die IGF-Kinase zu inhibieren: Die Substrat- und Autophosphorylierung der monomeren IGF-Kinase wird signifikant von dem Peptid gehemmt. Die inhibitorische Wirkung des Peptids ist sehr spezifisch für die Kinase des IGF-1R. Selbst die Kinase des nah verwandten IR wird von dem Peptid nicht gehemmt. Die Inhibition folgt einem nicht-ATP-kompetitiven Mechanismus. Die Aktivität der dimeren Kinase wird nicht beeinflusst. Das Peptid bindet gezielt die inaktive Kinase und verhindert den Dimerisierungsprozess. Zusätzlich entkoppelt das Peptid die Interaktion der Kinase mit der Phosphotyrosin-bindenden Domäne (PTB) des Insulinrezeptorsubstrtat-1 (IRS-1) und stellt somit einen Inhibitor der Signalweiterleitung dar. Diese Inhibition ist unabhängig von der Kinasestruktur. Das Phage Display gegen das Peptid aus der alpha-D-Helix/hinge region des IGF-1R lieferte eine Peptidsequenz, deren inhibitorische Wirkung deutlich stärker war als die des Peptids gegen die Juxtamembranregion: Das Peptid hemmt gezielt die monomere Kinase des IGF-1R; auf die dimere Kinase hat es keinen Einfluss. Durch die Bindung des Peptids an die hinge region wird die Kinase in ihrer autoinhibierten Konformation fixiert. Das Peptid inhibiert spezifisch nur die Mitglieder der Insulinrezeptorfamilie. Es bindet aber deutlich stärker an die Kinase des IGF-1R als an die IR-Kinase. Das Peptid inhibiert nicht-ATP kompetitiv. Somit konnten in dieser Arbeit zwei Peptidinhibitoren generiert werden, die an zwei unterschiedliche regulatorische Bereiche der inaktiven Kinasestruktur binden und den Aktivierungsprozess der Kinase hemmen. Zusätzlich inhibiert eines der Peptide die Signalweiterleitung der Kinasen unabhängig von ihrer Struktur.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Structure-based development of kinase inhibitors English
Translated abstract:	Abstract Language Both, the insulin-like growth factor receptor (IGF-1R) and the insulin receptor (IR) are members of the transmembrane receptor kinases, which belong to the family of growth factor receptors. IGF-1R is responsible for development, normal growth, and differentiation of cells, but also for suppression of apoptosis. The ability of the receptor to simultaneously initiate proliferation and anti-apoptotic signals indicates, that IGF-1R might might be an interesting target for drug development. Generally, common kinase inhibitors are small molecule inhibitors which show competitive inhibition with respect to ATP. As the ATP site is highly conserved across kinases those inhibitors might lead to undesirable side effects. Especially in the case of IGF-1R a selective inhibition is essential as a simultaneous inhibition of the closely related IR might lead to severe consequences e.g. the formation of a diabetic phenotype. To avoid those effects, the aim of this PhD was to develop a specific peptide inhibitor for the IGF-1R kinase. According to the common opinion, dimerisation is necessary for the activation of a receptor kinase. Therefore, my approach was based on preventing dimerisation by competition with sequence-specific peptides. This concept was to be realized for two regions of the IGF-1R and IR: One target was the juxtamembrane region which is supposed to have an auto regulatory function as well as a role in the dimerisation process of the kinase. In addition, IR and IGF-1R display significant sequential differences in this region. As other target the alpha-D-Helix/hinge region which is crucial for the transition of the inactive to the active conformation was chosen. To find a specific peptide ligand for both targets, a library of peptides with randomized amino acid sequences was screened by phage display. To generate the peptide sequence a technique was developed to express small peptides in high scales and purify them by affinity chromatography. Validation of the sequences derived from the phage display against the juxtamembrane region led to a peptide sequence which is able to inhibit the IGF-1R kinase in a micromolar range: Substrate- and autophosphorylation of the monomeric IGF-1-R kinase is significantly inhibited by the peptide. The inhibytory effect of the sequence is highly specific for the IGF-1 kinase. Even the closely related IR kinase is not affected by the peptide. Inhibition follows a non competitive mechanism with respect to ATP. The activity of the dimeric kinase is not impaired. The peptide binds selective to the inactive kinase and impairs dimerisation. Additionally, the inhibitory peptide degenerates the interaction of the phosphotyrosin binding domain (PTB) of insulin receptor substrate-1 (IRS-1) with the kinase. Hence the peptide acts as a inhibitor of signal transduction. This inhibition is independent of the kinase conformation. Phage display against a peptide composed of the alpha-D-helix/hinge region of IGF-1R provided a peptide sequence which inhibitory effect was significantly stronger compared to the effect of the peptide against the juxtamembrane region: This peptide inhibits specific the inactive monomeric kinase of IGF-1R while the activity of the dimeric kinase is not impaired. Binding of the inhibitory peptide to the hinge region leads to a fixation of the kinase in an autoinhibited conformation. The inhibitory effect is specific for members of the insulin receptor family. However binding of the peptide to the IGF-1R kinase is much more stronger as the binding to the kinase of the IR. Inhibition follows a non competitive mechanism with respect to ATP. Thus two peptide inhibitors could be generated, which bind to different regulatory regions of the unactivated kinase structure and inhibit the activation process. Additionally one peptide inhibits the signaltransduction independently of the kinase structure. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Wirtz, Dörthe Hendrike d.h.wirtz@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-28795
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Proteinkinase , IGF-1 Rezeptor , Inhibition , Phage Display German Proteinkinase , IGF-1 Receptor , Inhibition , Phage Display English
Date of oral exam:	24 June 2009
Referee:	Name Academic Title Klein, Helmut W. Prof.Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2879