Universität zu Köln

Karau, Daniel-Sebastian (2009). Was bestimmt die Spezifität einer Tyrosinkinase? PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Der Insulinrezeptor (IR) und der nah verwandte insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) sind Mitglieder der Familie der transmembranständigen Rezeptortyrosinkinasen. Nach Stimulation durch Insulin zeigt der IR in der Autophosphorylierung eine duale Aktivität, d.h. Phosphorylierung von Tyrosin- und Serinresten. Wird die lösliche Insulinrezeptorkinase als dimeres GST-Fusionsprotein exprimiert, so zeigt diese Kinase auch in der Autophosphorylierung duale Aktivität. Duale Substratphosphorylierung durch IR bzw. IGF-1R konnte nur beobachtet werden, wenn im Phosphorylierungsansatz Poly‑Lysin als "Vernetzer" in äquimolaren Konzentrationen vorlag. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen von Kinase-Substratkomplexen auf die Spezifität von Kinasen und auf nachgeschaltete Effektoren untersucht. Als Modellsubstrat wurde die Phosphotyrosin-bindende Domäne (PTB) des humanen Insulinrezeptorsubstrats (IRS-1) verwendet. Die PTB-Domäne weist sowohl die Eigenschaften eines "Vernetzers" auf, ist jedoch gleichzeitig ein geeignetes Substrat für die Kinasen des IR und IGF-1R. Dazu wurden verschiedene Varianten der PTB-Domäne kloniert, gereinigt und in Kinase-Assays eingesetzt. Als Modellenzyme wurden die lösliche, dimere GST‑getagte Kinasedomäne des IGF-1R verwendet, sowie eine Mutante dieser Kinase, in der die PTB-Bindung durch Substitution des essenziellen Tyrosin950 stark abgeschwächt ist. Es konnte gezeigt werden, dass Kinase und Substrat einen stabilen Komplex eingehen. Auf nachgeschaltete Effektorkinasen hat dieser Proteinkomplex weitreichende Auswirkungen. Eine Effektorkinase außerhalb des Signalosoms zeigte nur geringe katalytische Effizienz für das Substrat im Signalosom. Kinase und Substrat bilden 1:1-Komplexe, sodass eine "quasi"-intramolekulare Reaktion stattfindet. Somit unterliegt der Mechanismus der Substratphosphorylierung im Komplex keiner Michaelis-Menten-Kinetik. Durch den Kinase-Substrat-Komplex wird nicht nur die Aktivität der komplexierten Tyrosinkinase gesteigert, sondern darüber hinaus ihre Spezifität von Tyrosinphosphorylierung auf Serin- und Threoninphosphorylierung erweitert. Wird die Komplexbildung auf Seite der Kinase oder des Substrats pertubiert, so konnte keine Phosphorylierung des Substrats mehr beobachtet werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wird ein Modell der Kinasespezifität postuliert, das zwischen der Proteinbindung über "Docking"-Domänen und der Bindung von Substraten im katalytischen Zentrum unterscheidet. Dieses Modell erklärt die Spezifität von Tyrosinkinasen: Einer Kinase wird für jeden Phosphorylakzeptor im Substratprotein eine Präferenz zugeordnet, unabhängig davon, ob es sich um ein Tyrosin, Threonin oder Serin handelt. Diese Präferenz wird durch die Eigenschaften des Kinase-Substrat-Komplexes bestimmt. Hier ist die Aufenthaltsdauer des "Docking"-Proteins im Komplex mit der Kinase, sowie die Flexibilität der zu phosphorylierenden Aminosäurereste, entscheidend.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language What determines the specificity of a tyrosinkinase? English
Translated abstract:	Abstract Language The insulin receptor (IR) and the closely related insulin-like growth factor receptor (IGF-1R) are members of the transmembrane receptor tyrosine kinase family. IR autophosphorylation after insulin stimulation reveals dual activity, that is, phosphorylation of both tyrosine and serine residues. Insulin receptor kinase, if expressed as a soluble, dimeric GST-fusion protein, also displays dual activity during autophosphorylation. Dual substrate phosphorylation by IR or IGF-1R was detected only with a polylysine linker present in equimolar concentrations. In this thesis, the effects of kinase-substrate-complexes on the dual specificity of kinases and on downstream effectors were analyzed. The phosphotyrosine binding domain (PTB) of the insulin receptor substrate-1 (IRS-1) was used as a model substrate. PTB functions as both a linker and a suitable substrate for the kinase domain of the IR and the IGF-1R. Therefore, different variants of the PTB where cloned, purified and analyzed in kinase assays. The soluble, dimeric GST-fused kinase domain of the IGF-1R was used as a model enzyme, as well as a mutant of this kinase in which PTB binding is impaired by substitution of the essential tyrosine 950. A stable complex formation between kinase and substrate could be demonstrated. This complex has extensive impact on downstream effector kinases. An effector kinase beyond the signalosome shows only marginal catalytic activity towards the substrate at the signalosome. Kinase and substrate form a 1:1 complex, so that a "quasi"-intramolecular reaction appeared. Therefore, the mechanism of substrate phosphorylation within this complex does not comply with Michaelis Menten kinetics. Complex formation between kinase and substrate not only increases kinase activity but also extends kinase specificity from tyrosine phosphorylation to serine- and threonine phosphorylation. Perturbation of complex formation on the part of either the kinase or the substrate resulted in a total loss of substrate phosphorylation. Based on these results, a model for kinase specificity is postulated which distinguishes between protein binding by docking sites and binding of substrate amino acid residues to the catalytic cleft. This model explains the specificity of tyrosine kinases: the kinase exhibits a distinct preference for every phosphoryl acceptor within the substrate, regardless of this residue being a tyrosine-, threonine-, or serine residue. This preference is determined by the characteristics of the kinase-substrate-complex, particularly the duration of the binding of the docking substrate in complex, as well as the flexibility of the phosphoryl acceptor residues. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Karau, Daniel-Sebastian daniel.karau@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-28809
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language IGF1-R , PTB , Kinase , Spezifität , Serin German IGF1-R , PTB , Kinase , Specificity , Serine English
Date of oral exam:	23 June 2009
Referee:	Name Academic Title Klein, Helmut W. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2880