Aktivierungsanalysen der monomeren, dimeren und heteromeren Kinasen des Insulinrezeptors

Wassermann, Julia (2009). Aktivierungsanalysen der monomeren, dimeren und heteromeren Kinasen des Insulinrezeptors. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Dimerisierung führt bei Rezeptortyrosinkinasen (RTK) zur Aktivierung der Kinaseaktivität, die sich in der Autophosphorylierung der Dimere niederschlägt. Nach gängiger Meinung (Schlessinger et al. 1988/1989; Lammers et al. 1990; Ullrich et al. 1990) erfolgt die Phosphorylierung der Dimere in trans, d.h. die Untereinheiten phosphorylieren sich gegenseitig. Demnach sind Dimerisierung und trans-Autophosphorylierung unentbehrlich für den Aktivierungsprozess. Eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des Insulinrezeptors (IR) wird den Tyrosinpositionen der Aktivierungsschleife (Y1146, Y1150 und Y1151) zugesprochen (White et al., 1988). Des weiteren phosphoryliert die Insulinrezeptorkinase rezeptoreigene und im Substrat befindliche Serinreste und ist somit eine Kinase mit dualer Spezifität. In zahlreichen Mutationsanalysen wurde die Rolle der einzelnen Tyrosine für den Aktivierungsprozess des IRs und für die Signaltransduktion kontrovers diskutiert ( Tavare et al. 1991; Wilden et al. 1992; Zhang et al. 1991; Dickens und Tavare 1992). Jedoch ergab sich in in vivo- und in vitro- Untersuchungen kein eindeutiges Bild über die Bedeutung der einzelnen Tyrosinphosphorylierungsstellen. Dies kann an den unterschiedlichen Methoden liegen, die einen Vergleich der verschiedenen Ergebnisse erschweren. Allen Arbeiten ist gemeinsam, dass sich die Substitution aller drei Phosphorylierungsstellen in einer deutlichen Reduktion der Kinaseaktivität äußert (Wilden et al. 1992). Nicht nur die Bedeutung der Phosphorylierungsstellen, sondern auch die Reihenfolge ihrer Besetzung ist umstritten. Die Meinungen reichen von einer zufälligen Besetzung (Tavare und Dickens 1991) bis hin zu einem geordneten Besetzungsmuster (Dickens und Tavare 1992; Wei et al. 1995), wobei zwischen zwei möglichen Reihenfolgen unterschieden wird. Um ein homogenes Reaktionsfeld zur Analyse der zugrunde liegenden Mechanismen zu schaffen, wurden in dieser Arbeit unterschiedliche mutierte Homo-und Heterodimere Kinasekonstrukte des Insulinrezeptors generiert. Alle hergestellten Konstrukte wurden als GST-Fusionsproteine in den Sf9-Zellen exprimiert und affinitätschromotographisch gereinigt und in ihrer Aktivität in Auto- und Substratphosphorylierung charakterisiert. Die Untersuchung der verwendeten Kinase-Mutanten führte zu folgenden Ergebnissen: In Autophosphorylierungsreaktionen wiesen alle mononemeren, homo- und heterodimeren Kinasekonstrukte katalytische Aktivität auf. Folgende Tendenz konnte verzeichnet werden: WT=Y1151F=Y1146F>Y1150F. Keine der Mutationen in den potentiellen Phosphorylierungsstellen führte demnach zu einer Knockout-Mutante. Ein Vergleich der Hybride mit den zugehörigen homodimeren Referenzkinasen zeigte eine vergleichbare Aktivität der aktiven Untereinheiten im Hybrid und im Homodimer. Die Phosphopeptidkartierung der C-terminal verkürzten Kinasemutanten zeigt die Besetzung aller Tyrosine der Aktivierungsschleife, vergleichbar mit den Hybriden. Es wurden deutliche Unterschiede im Verhalten der einzelnen Mutanten in der Auto- und Substratphosphorylierung verzeichnet. Die Aktivität in der Substratphosphorylierung nahm in der Reihenfolge WT≤Y1146F>Y1150F>Y1151F ab. Die Besetzung der Position Y1151 spielt offenbar eine untergeordnete Rolle für die Autophosphorylierung, scheint jedoch für die Substratphosphorylierung bedeutend zu sein. Alle Kinasekonstrukte mit den Mutationen Y1150F und Y1151F haben die Fähigkeit zur dualen Phosphorylierung weitgehend verloren.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Dimerisation of receptor tyrosine kinases induces their activation, resulting in the autophosphorylation of the dimers. Current theory (Schlessinger et al. 1988/ 1989; Lammers et al. 1990; Ullrich et al. 1990) has it that this autophosphorylation acts in trans, that is, the subunits phosphorylate each other. Therefore, both dimerisation and trans-autophosphorylation are essential for the activation process. For the activation of the insulin receptor (IR), tyrosine residues located in the activation loop (Y1146, Y1150, and Y1151) are considered to play a key role (White et al., 1988). Furthermore, insulin receptor kinase phosphorylates serine residues in both the receptor itself and its substrates, revealing it to be a kinase with dual specificity. The roles of the individual tyrosine residues for both IR activation and signal transduction has been discussed controversially, using numerous mutation analyses (Tavare et al. 1991; Wilden et al. 1992; Zhang et al. 1991; Dickens and Tavare 1992). However, neither in vivo nor in vitro studies yielded conclusive results as to the importance of the individual tyrosine phosphorylation sites. This could be due to the range of different methods employed, which makes comparison of results a challenge. All studies agree on the substitution of all three tyrosine phosphorylation sites leading to a significant reduction in kinase activity. Not only the importance of the three phosphorylation sites, but also the order of their phosphorylation is subject to debate. Opinions range from random phosphorylation (Tavare and Dickens 1991) to an ordered pattern (Dickens and Tavare 1992; Wei et al. 1995), whereby two distinct orders are distinguished. To generate a homogenous reaction basis for the analysis of the underlying mechanisms, several mutants of homo- and heterodimeric kinase constructs of the insulin receptor were created during this study. All constructs were expressed as GST fusion proteins in Sf9 cells, purified via affinity chromatography, and characterized for their activity in auto- and substrate phosphorylation. Analysis of these kinase mutants led to the following results: During autophosphorylation, all monomeric, homodimeric, and heterodimeric kinase constructs displayed catalytic activity. The following tendency could be observed: WT=Y1151F=Y1146F>Y1150F. Therefore, none of the mutations in potential phosphorylation sites resulted in a knock-out mutant. A comparison of the hybrids with the respective homodimeric reference kinase showed a comparable activity of the active subunit in both hybrid and homodimer. Phospho-peptide mapping of the C-terminally shortened kinase mutants revealed phosphorylation of all tyrosine sites in the activation loop comparable to the hybrids. A significant differences were observed between the results of the auto- and substrate phosphorylation. Substrate phosphorylation activity decreased in the order of WT≤Y1146F>Y1150F>Y1151F. Apparently, position Y1151 plays only a subordinate role for autophosphorylation, but has a substantive role during substrate phosphorylation. All kinase constructs with the mutations Y1150F and Y1151F have the ability to dual phosphorylation largely lost. The mutation analysis of the activation loop shows that the activity of the insulin receptor is determined by an interaction involving all three phosphorylation sites of the activation loop.

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