Universität zu Köln

Zyl, Rebekka Maria van (2009). Untersuchung zur Speicherung und Funktion von Sulfatid in Neuronen anhand von transgenen Mäusen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine genetisch bedingte Defizienz des lysosomalen Enzyms Arylsulfatase A und führt zur lysosomalen Akkumulation von Sulfatid sowie einer schwerwiegenden Demyelinisierung im zentralen Nervensystem des Menschen. Ein Tier-Modell der MLD sind die ASA-Knockout-Mäuse, die durch die Inaktivierung des ASA-Gens erzeugt wurden. Die ASA-Knockout-Mäuse entwickeln lysosomale Sulfatid-Speicherungen ähnlich wie bei der humanen MLD.Galaktosylceramid (GalCer) und 3-O-Sulfogalactosylceramid (Sulfatid) gehören zu den häufigsten Sphingolipiden in Myelin-produzierenden Glia-Zellen, konnten jedoch beide auch in Neuronen nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um endogenes oder aus Glia-Zellen stammendes GalCer und Sulfatid handelt, ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Han beschrieb ein Modell, in dem Sulfatid durch Apolipoprotein E von Astrozyten zu Neuronen transportiert wird. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Sulfatid-Akkumulation in den Neuronen von ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Mäusen. Unabhängig vom zusätzlichen eingebrachten ApoE-Knockout zeigten die ASA/ApoE-Knockout-Mäuse ebenso wie die ASA-Knockout-Mäuse einen gleichsam erhöhten Sulfatid-Gehalt im Cortex und im gesamten Gehirn im Alter von 18-24 Monaten. Die Sulfatid-Akkumulation wurde durch histochemische Färbungen mit Alcianblau nachgewiesen. Sulfatid-Speicherung wurde bereits bei jüngeren Tieren (12 Monate) und verstärkt bei den älteren Tieren in Neuronen bei den ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Mäusen detektiert. Die neuronale Sulfatid-Anreicherung, besonders im Bereich der Medulla oblongata und Pons, deutet darauf hin, dass die ApoE-Defizienz in den Doppel-Knockout-Tieren keinen wesentlichen Einfluss auf die Akkumulation von Sulfatid in Neuronen hat.Daher ist die Anreicherung von Sulfatid entweder von einem anderen Transporterweg abhängig, oder die Akkumulation in den Neuronen entsteht durch endogen synthetisiertes Sulfatid. Transgene Thy-1-CGT-Mäuse überexprimieren die Ceramid-Galaktosyltransferase (CGT) unter dem neuronalen Promotor Thy-1 und synthetisieren in den Neuronen C18:0-GalCer und Sulfatid in verschiedenen Bereichen des Gehirns. Diese transgenen CGT-Mäuse weisen auf dem C57BL/6Hintergrund eine signifikant reduzierte Lebensspanne auf. Zusätzlich wurde bei den transgenen CGT Mäusen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber akustischen Reizen festgestellt. Nach einer relativ milden Geräusch-Stimulation wie Schlüsselklirren (ca. 90-100 dB) entwickelten die transgenen CGTTiere letale audiogene Anfälle, die sich in unkontrolliertem Hin- und Herlaufen äußerte, die mit Krämpfen verbunden waren und sogar teilweise zum Tod des transgenen Tieres führten. Allerdings konnten bei den transgenen Mäusen, die die Cerebrosid-Sulfotransferase (CST) in den Neuronen überexprimieren, keine solchen Anfälle beobachtet werden. In Doppel-Transgenen Tieren, die sowohl CGT wie CST exprimieren, wurde dagegen eine stärkere Sensitivität gegen audiogene Reiz-Induktion im Vergleich zu den transgenen CGT-Mäusen erfasst. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, korreliert diese verstärkte audiogene Sensitivität mit dem erhöhten Sulfatid-Gehalt in der neuronalen Plasmamembran von CST/CGT-transgenen Mäusen im Vergleich zu transgenen CGT-Mäusen. Verursacht durch den erhöhten Sulfatid-Gehalt in den Neuronen kommt es zu den letalen audiogenen Anfällen bei den transgenen Mäusen. Eine mögliche therapeutische Option für die lysosomale Speicherkrankheit MLD ist die Substrat-Reduktions-Therapie, wobei die Synthese des akkumulierenden Sulfatids durch spezifische Inhibitoren verhindert werden soll. Im Falle der MLD wird der letzte Schritt der Sulfatid-Synthese, der Transfer einer Sulfatgruppe auf Galaktosylcerebrosid von der CST katalysiert. Die Produktion einer großen Menge an CST-Protein sollte es ermöglichen, eine detaillierte Struktur-Analyse sowie die Testung von potentiellen Inhibitoren durchzuführen. Allerdings wird die Expression einer großen Menge des CST-Proteins durch dessen ineffizienten Export aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) erschwert. Untersuchungen mit verschiedenen CST-Fusions-Proteinen ergaben, dass die CST zum größten Teil im ER zurückgehalten wird. Diese ER-Retention könnte möglicherweise durch die luminale katalytische Domäne hervorgerufen werden. Ein Fusions-Protein aus der amino-terminalen Membran-Domäne der CST und einem GFP-Reporter-Protein wurde effizient in den Golgi-Apparat transportiert, im Gegensatz dazu verblieb ein Fusions-Protein,bestehend aus der katalytischen Domäne der CST und der amino-terminalen Transmembran-Domäne eines Plasmamembran-Proteins (Dipeptidylpeptidase IV), im ER.Da die relative Menge des im ER zurückgehaltenen CST-Proteins mit dem Expressions-Gehalt ansteigt,könnte der Transport der CST aus dem ER durch einen noch unbekannten ER-Export-Faktor limitiert sein.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Analysis of sulfatide function and storage in neurons on the basis of transgenic mice English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zyl, Rebekka Maria van rebekkavanzyl@netcologne.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-29122
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Sulfatid, metachromatische Leukodystrophie, ASA-Knockout Maus, transgene Mäuse German
Date of oral exam:	25 October 2009
Referee:	Name Academic Title Schwarz, Guenter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2912