Universität zu Köln

Gandhirajan, Rajesh Kumar (2009). LEF-1 is a potential therapeutic target in the treatment of Chronic lymphocytic leukemia. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

B-Chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is characterized by accumulation of apoptotic resistant CD5+ B lymphocytes. There is an increased secretion of Wnt ligands indicating an autocrine loop leading to the extended survival of B-CLL cells. Lymphoid enhancer factor 1 (LEF-1) is a potent transcription factor regulating the expression of several Wnt induced target genes. A comprehensive gene expression profiling from two independent studies revealed that LEF-1 mRNA was ~3000 fold overexpressed in B-CLL when compared to its healthy counterpart. The objective of this present study is to demonstrate the therapeutic benefit of inhibiting LEF-1 expression in B-CLL cells using novel small molecule inhibitors CGP049090 and PKF115-584 in vivo and in vitro. In order to explore the anti-leukemic potential of CGP049090 and PKF115-584 we tested its effects on freshly isolated B-CLL cells, prolymphocytic cell line (JVM-3 & MEC-1) and in a subcutaneous mouse xenograft model. The present study shows that, in freshly isolated B-CLL cells there was high protein expression and nuclear localization of LEF-1 and β-catenin indicating active LEF-1 mediated transcription whereas LEF-1 remained undetectable in healthy B cells. Preliminary experiments of LEF-1 inhibition using siRNAs resulted in increased apoptosis indicating LEF-1 plays an important role in the survival of B-CLL cells. This observation was extended using CGP049090 and PKF-115584 as they induce dose dependent cytotoxicity in B-CLL, whereas the healthy B cells are not significantly affected. The half maximal inhibitory concentration (IC50) was less than 1 µM in primary B-CLL cells and cell lines whereas it was more than 5 µM in healthy B cells. CGP049090 and PKF-115584 induced apoptotic cell death in primary B-CLL cells and cell lines by cleavage of caspases 8, 9, 3 and 7 and subsequent cleavage of Poly (adenosine diphospate-ribose) polymerase (PARP). Both inhibitors also altered the expression of several anti-apoptotic proteins like X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein (XIAP), Mantle cell lymphoma-1 (Mcl-1) and B cell lymphoma-2 (Bcl-2). Co-Immunoprecipitation experiments revealed that both the inhibitors effectively disrupt the β-catenin/LEF-1 interaction, resulting in the down regulation of LEF-1 target genes such c-myc, cyclin D1 and LEF-1. Furthermore, when the inhibitors were tested in an in vivo JVM-3 subcutaneous xenograft nude mouse model, more than 70% inhibition of tumor growth and an increase in the median survival of the treated group without leading to systemic toxicity was observed. Immunohistochemistry analysis of the tumor sections revealed LEF-1 down regulation and subsequent inhibition of proliferation by down regulation of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) and increase in apoptosis (cleaved PARP). In summary, the data showed that LEF-1 is a potential therapeutic target in the treatment of B-CLL. Both CGP049090 and PKF115-584 showed potent inhibitory effects on the survival of CLL cells in vitro and in vivo without affecting the healthy cells. Both CGP049090 and PKF115-584 are hence, potential anti-cancer agents in B-CLL and other neoplastic malignancies with aberrant LEF-1/ T cell factor (TCF) transcriptional activity. Further investigations are warranted to determine the feasibility of these small molecules for therapeutic approach in humans.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language LEF-1 ist ein mögliches therapeutisches ziel in der behandlung der chronischen lymphozytischen Leukämie German
Translated abstract:	Abstract Language Die chronische lymphatische B-Zell Leukämie (B-CLL) ist durch eine Akkumulation von apoptose-resistenten CD5-positive B-Lymphozyten charakerisiert. In letzter Zeit wurden verschiedene Faktoren beschrieben, welche zu einer aberranten Aktivierung der Wnt-Signalkaskade in B-CLL Zellen beitragen. Eine vermehrte Sekretion von Wnt-Liganden weist auf einen autokrinen Rückkopplungsmechanismus hin, welcher eine Rolle im gesteigerten Überleben der B-CLL Zellen spielt. LEF-1 ist ein potenter Transkriptionsfaktor, welcher die Expression verschiedener Wnt-induzierter Zielgene reguliert. LEF-1 wurde in zwei unabhängigen Genexpressionsanalysestudien als Gen mit etwa 3000-facher Überexpression in der B-CLL, relativ zum Expressionslevel in gesunden B-Zellen, beschrieben. Der Transkriptionsfaktor LEF-1 ist damit exklusiv auf B-CLL Zellen exprimiert. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, den therapeutischen Nutzen einer gezielten Inhibierung von LEF-1 in B-CLL Zellen, durch die Verwendung zweier sogenannter �small molecule� Inihibitoren CGP049090 and PKF115-584, sowohl in vivo als auch in vitro zu zeigen. Um den anti-leukämischen Effekt dieser Substanzen zu zeigen, wurden deren Effekte auf frisch isolierte B-CLL Zellen und prolymphozytischen Zelllinien ((JVM-3 & MEC-1) untersucht. Zudem wurden beide Substanzen auf Ihre Wirksamkeit in einem JVM3-Xenograft Mausmodel getestet. In frischen B-CLL Zellen konnten wir große Proteinmengen von LEF-1 detektieren, welche größtenteils im Zellkern zu finden waren. Auch β-Catenin war vorrangig im Zellkern vorhanden, was darauf schließen lässt, dass LEF-1 in B-CLL Zellen transkriptionell aktiv ist. LEF-1-Protein war in gesunden B-Zellen nicht detektierbar. Eine Runterregulierung von LEF1 mittels siRNA hat zu einem vermehrten Zellsterben durch Apoptoseinduktion geführt, welches die wichtige Funktion von LEF-1 für das Überleben der B-CLL Zelle zeigt. Diese Beobachtung wurde dadurch erweitert, dass auch CGO049090 und PKF-115584 sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig zytotoxisch auf B-CLL Zellen wirken, während gesunde B-Zellen in signifikant geringerem Maße betroffen sind. Die IC50 in primären B-CLL Zellen war <1 µM und >5 µM in gesunden B-Zellen. CGO049090 und PKF-115584 führten zu apoptotischem Zelltod durch eine Spaltung der Caspasen 8, 9, 3 und 7 und eine darauffolgende Spaltung von poly (adenosine diphospate-ribose) polymerase (PARP). Beide Inhibitoren führten zudem zu einer veränderten Expression verschiedener antiapoptotischer Proteine wie X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein (XIAP), Mantle cell lymphoma-1 (Mcl-1) und B cell lymphoma-2 (Bcl-2). Co-Immunoprezipitationsexperimente zeigten, dass beide Inhibitoren effektiv den β-Catenin/LEF-1 Komplex trennen, was zur Herunterregulation der LEF-1 Zielgene c-myc, cyclin D1 und LEF-1 führt. Darüber hinaus wurden beide Inhibitoren in einem subkutanen JVM-3-Xenograft Nacktmausmodel getestet und erzielten eine Tumorinhibitionsrate von >70%. Zudem erhöhte sich die mittlere Überlebensrate der Mäuse durch die Behandlung ohne erkennbare systemisch toxische Effekte. Eine Gewebeuntersuchung der Tumore ergab eine Herunterregulation von LEF-1 und eine darausfolgende Herunterregulation des Proliferating Cell Nuclear Antigens (PCNA), welches auf eine erniedrigte Proliferationsrate hinweist. Zudem wurde eine verstärkte Aktivität von PARP detektiert, wodurch auf eine erhöhte Apoptoseinduktion im Tumorgewebe behandelter Mäuse geschlossen werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LEF-1 einen potentiellen therapeutischen Ansatzpunkt in der B-CLL darstellt. Die beiden Substanzen CGP049090 and PKF115-584 weisen eine hohe Wirksamkeit bei der Zelltodinduktion B-CLL Zellen gegenüber auf, während sie gesunde B-Zellen kaum beeinträchtigen. CGP049090 and PKF115-584 eignen sich deshalb als potentielle Substanzen in der B-CLL Therapie und auch in anderen neoplastischen Erkrankungen, die eine aberrierende transkriptionelle Aktivität von LEF-1/TCF aufweisen. Weitere Untersuchungen sind wünschenswert um die Anwendbarkeit dieser zwei Substanzen für therapeutische Zwecke im Menschen genauer zu bestimmen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Gandhirajan, Rajesh Kumar rajeshkumar.gene@gmail.com, 017686342493 UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-29143
Date:	2009
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Zoologisches Institut
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language CLL LEF-1 CGP049090 PKF115-584 JVM-3 German CLL LEF-1 CGP049090 PKF115-584 JVM-3 English
Date of oral exam:	14 October 2009
Referee:	Name Academic Title Plickert, Guenter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2914