Charakterisierung der P-Typ ATPase Ypk9 in Saccharomyces cerevisiae als Modell für die ATP13A2-bedingte Form der Neurodegeneration

Stiller, Barbara (2009). Charakterisierung der P-Typ ATPase Ypk9 in Saccharomyces cerevisiae als Modell für die ATP13A2-bedingte Form der Neurodegeneration. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Mutationen in der humanen Typ V P-Typ ATPase ATP13A2 führen zum Kufor-Rakeb Syndrom, einer juvenilen Form des Parkinsonismus, welche neben den drei klinischen Kardinalsymptomen der Parkinsonerkrankung auch eine Spastik, eine supranukleäre Blickparese und eine Demenz zeigt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten mit Hilfe des Modellorganismus S. cerevisiae Erkenntnisse über die Funktion dieser bisher relativ wenig untersuchten Gruppe von P Typ ATPasen gewonnen werden, um somit letztlich das Verständnis über molekulare Mechanismen der Neurodegeneration zu erweitern. Mittels bioinformatischer Analysen konnten im S. cerevisiae Genom zwei Typ V P-Typ ATPasen, SPF1 und YPK9, identifiziert werden, von denen YPK9 mit 36 % Identität und 57 % Ähnlichkeit die größte Homologie zu ATP13A2 aufzeigte. Anhand einer durchgeführten subzellulären Lokalisierung konnte das Ypk9-Protein in der vakuolären Membran nachgewiesen werden. Da die Vakuole das zu den Lysosomen der Säugetierzelle analoge Hefe-Organell ist und Atp13a2 lysosomal lokalisiert, schien es aufgrund der Sequenzanalyse und der subzellulären Lokalisation plausibel, dass YPK9 das Specieshomolog von ATP13A2 ist. Für die nicht letale Deletion von YPK9 in S. cerevisiae war zu Beginn der Arbeit im Rahmen systematischer Untersuchungen kein Phänotyp gefunden worden. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit verschiedene spezifische Hypothesen bezüglich eines möglichen Phänotyps des dypk9-Stamms getestet werden, um somit möglicherweise zu der Aufklärung der Funktion des Proteins beitragen und gleichzeitig ein zelluläres System hinsichtlich der Pathogenitätsprüfung humaner ATP13A2-Mutation etablieren zu können. Da die Degradation von Proteinen eine zentrale vakuoläre/lysosomale Funktion darstellt und ein gestörter lysosomaler Proteinabbau bereits häufig mit Neurodegeneration in Verbindung gebracht worden war, sollte zuerst der Prozess der Autophagie anhand zweier verschiedener Assays überprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Funktionsverlust als auch die Überexpression von Ypk9 keinen Einfluss auf die Rate der Makroautophagie hatte, so dass die Vakuole also trotz des Funktionsverlustes bzw. der Überexpression von Ypk9 zu einem Abbau zellulären Materials fähig zu sein scheint. Die nächste Hypothese adressierte den Prozess des Alterns, bei dem häufig dieselben Formen zellulären Stresses auftreten, die auch bei neurodegenerativen Erkrankungen zu finden sind. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der Funktionsverlust von Ypk9 keine Veränderungen der replikativen Lebensspanne von S. cerevisiae bedingt. Da über das Substrat von Ypk9 und anderen Typ V P-Typ ATPasen bisher keine Erkenntnisse vorlagen, wurde das Wachstum des dypk9-Stammes bei semitoxischen Konzentrationen verschiedener Leicht- und Schwermetalle getestet, die als mögliche Substrate in Frage kommen könnten. Neben einer schwachen Sensitivität des dypk9-Stamms gegenüber einer hohen Konzentration von Calcium konnte weiterhin eine erhöhte Sensitivität gegenüber Mangan, welches bei chronischer Belastung Auslöser des dem Parkinsonismus ähnelnden Krankheitsbild Manganismus ist, beobachtet werden. Diese erhöhte Mangantoxizität zeigte sowohl auf festem als auch in flüssigem Medium eine Dosis-Wirkungsbeziehung und konnte durch exogene Ypk9-Expression supprimiert werden. Zudem konnte eine Unterdrückung des Phänotyps durch die Überexpression des ebenfalls in der vakuolären Membran lokalisierten putativen Fe2+/Mn2+-Transporters Ccc1 beobachtet werden. Dies könnte auf eine mögliche überlappende Funktion beider Proteine hinweisen und evtl. zur Einordnung der Rolle des Ypk9-Proteins im Mangan-Stoffwechsel von S. cerevisiae beitragen. Interaktionen von YPK9 mit zwei weiteren in die Mangan-Homöostase involvierten Genen, PMR1 und MAM3, konnten demgegenüber nicht beobachtet werden. Eine Komplementation der Mangan-Sensitivität des dypk9-Stamms mit humanem Atp13a2, was die Basis für die Etablierung eines Assay-Systems zur Analyse putativer ATP13A2-Mutationen darstellen würde, konnte nicht nachgewiesen werden. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass es in S. cerevisiae zur Instabilität des humanen Atp13a2-Proteins kommt, welches im Westernblot nicht nachweisbar war. Weiterführende Analysen bezüglich der Sensitivität gegenüber Mangan in einem Säuger-Zellsystems zeigten für Atp13a2-defiziente humane Fibroblasten ebenfalls eine statistisch signifikant erhöhte Mangan-Sensitivität gegenüber gesunden Kontrollfibroblasten. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass auch das humane Atp13a2 an der zellulären Mangan-Homöostase beteiligt ist. Diese Beobachtung weist auf eine mögliche Verbindung von genetischen und umweltbedingten Ursachen des Parkinsonismus hin und könnte somit möglicherweise bei der weiteren Aufklärung des molekularen Pathomechanismus dieser multifaktoriellen neurodegenerativen Erkrankung hilfreich sein.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Characterization of the P-type ATPase Ypk9 in Saccharomyces cerevisiae as a model for neurodegeneration caused by mutations in ATP13A2	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Mutations in ATP13A2, a human type V P-type ATPase, cause Kufor-Rakeb syndrome, which is a form of juvenile parkinsonism showing spacticity, supranuclear gaze palsy and dementia besides the typical triad of parkinsonism symptoms. The aim of this thesis was to gain new insights into this so far poorly understood group of P-type ATPases through the model organism S. cerevisiae to extend the current understanding of the molecular mechanisms of neurodegeneration. Bioinformatical analyses led to the identification of two type V P-type ATPases within the S. cerevisiae genome, SPF1 and YPK9, with YPK9 showing the highest homology to ATP13A2 with 36 % identity and 57 % similarity. While the subcellular localization of human Atp13a2 is the lysosomal membrane, Ypk9 could be localized to the membrane of the analogous organelle in S. cerevisiae, the vacuole. Thus, besides the sequence analyses also the shared subcellular localizations support the assumption that YPK9 is the species homologue of ATP13A2. At the start of this thesis, none of the already performed systematic studies showed any phenotype for the non-lethal deletion of YPK9 in S. cerevisiae. Hence different specific hypotheses concerning possible phenotypes for dypk9 should be addressed within this thesis to help to uncover protein function and to establish a system to analyse ATP13A2-mutations with respect to their pathogenicity. Degradation of proteins is a central vacuolar/lysosomal process and a defect in lysosomal protein degradation is known to play a role in neurodegeneration. Therefore, autophagy should initially be analyzed using two different methods. It could be shown that neither a defect in Ypk9 function nor Ypk9 overexpression influenced autophagic rate, suggesting that the vacuole is still capable of degrading cellular material under these conditions. The next hypothesis addressed a process which often shows the same kind of cellular stress as neurodegenerative diseases: ageing. However, loss of Ypk9 function did not alter S. cerevisiae replicative life span. Substrate specificity of Ypk9 and of the other type V P-type ATPases is still unknown. For this reason, dypk9 growth was tested with semitoxic concentrations of different light and heavy metals which could be putative substrates. Apart from a weak sensitivity of dypk9 to a high concentration of calcium, sensitivity to manganese, which after chronic exposure leads to the parkinsonism like disease manganism, could also be observed. Manganese sensitivity occurred in dypk9 cells grown on solid as well as in liquid media in a dose-dependent manner and could be rescued through exogenous Ypk9 expression. Furthermore, the putative Fe2+/Mn2+-transporter Ccc1, which also localizes to the vacuolar membrane, was able to rescue the phenotype. Pointing to a shared function of both proteins, this observation may help to elucidate the part of Ypk9 within S. cerevisiae manganese homeostasis. Interactions with PMR1 and MAM3, which are also involved in manganese homeostasis, could not be observed. Complementation of dypk9 sensitivity with the human Atp13a2, which would be essential for an assay testing putative ATP13A2 mutations with respect to their pathogenicity, could not be seen. This is possibly due to the instability of the human Atp13a2 protein in S. cerevisiae, as it could not be detected by western blot analysis. Further investigation of manganese sensitivity in a mammalian system led to the observation that Atp13a2-deficient human fibroblasts also showed statistically significant higher manganese sensitivity than healthy control fibroblasts. Thus, it could be shown for the first time that human Atp13a2 is involved in cellular manganese homeostasis. This observation suggests a link between genetic and environmental causes of parkinsonism and may help to further elucidate the molecular pathomechanism of this multifactorial neurodegenerative disorder.

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