In vitro and in vivo characterization of histone deacetylase inhibitors as potential therapeutics for autosomal recessive proximal spinal muscular atrophy (SMA)

Rießland, Markus (2009). In vitro and in vivo characterization of histone deacetylase inhibitors as potential therapeutics for autosomal recessive proximal spinal muscular atrophy (SMA). PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Spinal muscular atrophy is a common autosomal recessive neuromuscular disorder and the leading hereditary cause of death in early childhood. No cure is available. The disease determining gene for SMA is the survival motor neuron gene 1. SMN1 produces full length transcripts only, whereas the majority of transcripts derived from the copy gene SMN2 lack exon 7 due to alternative splicing. Although the amount of fully-functional SMN2-derived FL-SMN protein is not sufficient to overcome the absence of SMN1 and to prevent disease onset, SMN2 has been shown to be the main disease modifying gene. SMN2 is present in all SMA patients, which all lack functional SMN1. Therefore, and due to its disease modifying property, SMN2 became the most interesting target for a potential SMA therapy. It has been proven that epigenetic modification by HDACi activates the transcription of SMN2. Additionally, HDACi treatment has been shown to modulate the splicing pattern of SMN2 by the up-regulation of the splicing factor SFRS10, resulting in increased FL-SMN levels. Elevation of the SMN protein level was proven to ameliorate SMA progression in vitro, ex vivo and in vivo. In the present work two newly identified second generation HDAC inhibitors of different chemical classes, namely M344 and FK228, were shown to be able to elevate SMN and SFRS10 protein levels in fibroblast cell lines derived from SMA patients. Moreover, it was proven by quantitative real-time PCR that both HDACis up-regulated the FL-SMN2 transcript amounts and revealed no change or even a decrease in the delta7-SMN2 level indicating a reversion of the splicing pattern. The ability to correct the SMN2 splicing was confirmed by the finding that both substances were able to elevate SFRS10 protein levels. Semi-quantitative Western blot analysis revealed that the treatment with M344 resulted in an up to 7-fold and with FK228 in an up to 4.4-fold augmentation of the SMN protein level. FK228 proved its efficacy to elevate SMN levels also in a murine fibroblast line derived from a SMA-like mouse, indicating potency to modulate SMN2 expression regardless of the genetic background. Both substances were able to increase the number of subnuclear gems, indicating the elevated production of fully-functional SMN proteins. However, the performed MTT-assays revealed for both substances an in vitro toxicity profile, which restrained further in vivo characterization. To identify the HDAC isoenzyme involved in SMN2 expression regulation, all 11 classical HDACs were knocked-down by siRNA. Only after the KD of HDAC8, the SMN protein level was significantly up-regulated. HDAC8 overexpression experiments were performed, which could prove that HDAC8 activity regulates the SMN protein expression. ChIP experiments revealed that HDAC8 binds to the promoter region of SMN2, resembling the involvement in the epigenetic regulation of SMN2 expression. This finding was confirmed by treating SMN1 deleted fibroblasts with HDAC8 specific inhibitor. qRT-PCR expression analysis and semi-quantitative Western blots revealed that the up-regulation of SMN by PCI-34051 resembled the elevation of SMN by the knock-down of HDAC8. Previously, our group has shown for the first time that the FDA-approved drug SAHA is able to elevate the SMN level in vitro and ex vivo. Thus, this work proved that SAHA is a potent and non-toxic candidate drug for SMA treatment, since the in vivo characterization of this compound revealed a beneficial effect on disease progression in two different SMA mouse models. Since the SMN2 copy number is crucial for the severity of SMA, a real-time PCR based assay was developed to precisely determine the SMN2 copy number of SMA-like mice. In the very severe SMA mouse model SAHA treatment of the pregnant mother mice could prevent embryonic lethality of the SMA-like mice. In another SMA mouse model, which was here characterized for the first time in detail, the direct application of SAHA to the SMA-like mice revealed a significant amelioration of the SMA progression. The mean lifespan was increased by ~30%, from 9.9 to 12.9 days. Moreover, the SAHA-treated SMA-like mice showed better motor function abilities. Additionally, in histochemical attempts it was shown that SAHA-treated SMA-like mice revealed less degeneration of the a-motor neurons in the anterior horns of the spinal cord and larger muscle fibers. Immunofluorescence stains proved that SAHA-treated SMA mice showed an increase in neuromuscular junction size. Furthermore, qRT-PCR approaches as well as quantitative Western blotting displayed that SAHA treatment elevated SMN protein and transcript levels in the brain, spinal cord, muscle and liver. Although SAHA was able to ameliorate the SMA phenotype, it was not able to fully rescue the mice from disease progression. Since SAHA is an FDA-approved drug and was shown to ameliorate the SMA progression, it can be considered as an attractive candidate for a potential SMA therapy.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
In vitro und in vivo Charakterisierung von Histondeacetylase-Inhibitoren als potentielle Therapeutika für autosomal rezessive proximale spinale Muskelatrophie (SMA)	German

Translated abstract:

Abstract

Language

SMA ist eine häufige autosomal rezessive neuromuskuläre Erkrankung. Die Krankheit wird hervorgerufen durch den homozygoten Verlust des survival motor neuron Gens. SMN1 produziert ausschließlich Volllänge-Transkripte, wohingegen bei ~90% der Transkripte der Genkopie SMN2, bedingt durch alternatives Spleißen, das Exon 7 fehlt. Obwohl die Menge des vom SMN2 Gen produzierten voll funktionstüchtigen VL-SMN Proteins nicht ausreicht, das Ausbrechen der Krankheit zu verhindern, ist dennoch SMN2 das wichtigste krankheitsmodifizierende Gen. Zudem trägt jeder SMA Patient mindestens eine SMN2 Kopie. SMN2 wurde zum interessantesten Zielgen für eine potenzielle SMA Therapie. Es konnte gezeigt werden, dass durch epigenetische Modifizierung durch HDACis, die SMN2 Transkription aktiviert werden kann. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei neu identifizierte HDACis M344 und FK228, fähig sind, die SMN und die SFRS10 Proteinmenge in Fibroblastenkulturen von SMA Patienten heraufzuregulieren. Außerdem konnte mit Hilfe von quantitativer qRT-PCR gezeigt werden, dass beide Substanzen eine Erhöhung der VL-SMN2 Transkriptmenge und keine Veränderung oder sogar eine Abnahme der delta7-SMN2 Transkriptmenge verursachen, was für eine Revertierung des SMN2 Spleißmusters spricht. Durch semiquantitative Western blots konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit M344 zu einer 7-fachen und mit FK228 zu einer 4,4-fachen Steigerung der SMN Proteinmenge führte. Um dasjenige HDAC-Isoenzym zu identifizieren, welches hauptsächlich in der Regulation der SMN2 Expression involviert ist, wurde die Expression aller 11 "klassischen HDACs" mit Hilfe von siRNA ausgeschaltet (knock-down). Nur nach Ausschalten von HDAC8 zeigte sich die SMN Proteinmenge signifikant erhöht. Desweiteren konnte durch Überexpression von HDAC8 die SMN Proteinmenge herunterreguliert werden. ChIP bewiesen, dass HDAC8 im Promoter des SMN2 Gens bindet, was eine Beteiligung in der epigenetischen Regulation der SMN2 Expression nahe legt. Diese Ergebnisse konnten durch die Behandlung von SMN1-deletierten Fibroblasten mit einem HDAC8-spezifischen Inhibitor bestätigt werden. qRT-PCR Expressionsanalyse und Western blots bestätigten, dass das Ausmaß der Heraufregulierung von SMN durch PCI-34051 dem entsprach, welches nach dem KD von HDAC8 beobachtet wurde. Um ein potenzielles Medikament für eine SMA-Therapie zu identifizieren, ist es nötig, seine Wirksamkeit in in vivo Versuchen zu bestätigen. Vorausgehend konnte unsere Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen, dass das von der FDA zugelassene Medikament SAHA in der Lage ist, die SMN Mengen in vitro und ex vivo zu erhöhen. Diese Arbeit zeigt, dass SAHA ein sehr potenter Wirkstoff für eine SMA-Therapie ist, da diese Substanz in der in vivo Charakterisierung sehr positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf in zwei unterschiedlichen Mausmodellen für SMA zeigte. Da die Anzahl der SMN2 Genkopien entscheidend für den Schweregrad der SMA ist, wurde zunächst eine qRT-PCR basierende Methode entwickelt, mit der es möglich ist, die exakte SMN2 Kopienanzahl zu bestimmen. In einem Mausmodell mit sehr schwerer SMA-Verlaufsform, konnte die SAHA-Behandlung der Muttertiere die embryonale Letalität der SMA-Mäuse verhindern. In einem weiteren SMA-Mausmodell, welches hier zum ersten Mal ausführlich beschrieben wurde, zeigte die direkte Applikation von SAHA in die SMA-Mäuse eine deutliche Abschwächung des Krankheitsverlaufs. Die durchschnittliche Lebensdauer der erkrankten Tiere konnte durch SAHA-Behandlung von 9,9 auf 12,9 Tage um ~30% verlängert werden. Darüber hinaus zeigten die SAHA-behandelten SMA-Mäuse im Vergleich zu unbehandelten bessere motorische Fähigkeiten. Histochemische Untersuchungen bewiesen, dass die mit SAHA behandelten SMA-Mäuse eine verringerte Degeneration der a-Motoneuronen in den Vorderhörnern des Rückenmarks und durchschnittlich im Querschnitt größere Muskelfasern aufwiesen. Außerdem wiesen die behandelten SMA-Tieren größere neuromuskuläre Endplatten auf als die unbehandelten. Zudem wurde durch qRT-PCR Expressionsanalysen und Western blots festgestellt, dass SAHA-Behandlung die SMN2 Transkript- und Proteinmenge in Gehirn, Rückenmark, Muskel und Leber erhöhte. SAHA ist zwar in der Lage den Krankheitsverlauf abzuschwächen, aber nicht den Ausbruch der SMA komplett zu verhindern. Da SAHA ein zugelassenes Medikament ist und hier gezeigt werden konnte, dass es den Krankheitsverlauf der SMA positiv beeinflussen kann, sollte der Wirkstoff als ein vielversprechender Kandidat für eine potenzielle SMA-Therapie in Erwägung gezogen werden.

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