Universität zu Köln

Heimbach, André (2009). Identifizierung und Charakterisierung von ATP13A2-Varianten und ihre Bedeutung für neurodegenerative Erkrankungen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Das Kufor-Rakeb Syndrom (KRS) ist eine seltene, neurodegenerative Erkrankung, bei der die Patienten neben charakteristischen Kennzeichen des Parkinsonismus zusätzliche Symptome wie eine Spastik und eine Demenz entwickeln. Es handelt sich um eine autosomal rezessive Erkrankung, deren erste Symptome bereits im Jugendalter auftreten. Die genetische Ursache des KRS sind biallelische Mutationen im ATP13A2-Gen auf Chromosom 1p36. ATP13A2 kodiert für eine P-Typ Typ V ATPase mit zehn prädizierten Transmembrandomänen und einem Molekulargewicht von etwa 135 kDa, dessen Funktion und Substratspezifität allerdings bislang unbekannt sind. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung beschriebener Genvarianten in ATP13A2 auf zellulärer Ebene zum besseren Verständnis der Pathogenese des KRS bzw. verwandter Formen des Parkinsonismus. Zur in vivo Analyse der motorischen und kognitiven Funktionsstörungen sollte zusätzlich eine Knock-Out Maus generiert werden, bei der Atp13a2 konstitutiv deletiert ist. Insgesamt wurden 15 verschiedene humane Mutationen in vitro untersucht, von denen acht bei Patienten mit typischer Parkinsonerkrankung (PD-Mutationen) und sieben bei KRS-Patienten identifiziert worden waren. Bei elf dieser Veränderungen handelte es sich um Missense-Veränderungen (P1-P8; K4-K6). Es gibt keinen Hinweis darauf, dass der jeweilige Aminosäurenaustausch einen Effekt auf die Konformation des Proteins hat. In zwei Fällen der bei KRS-Patienten identifizierten ATP13A2-Veränderungen war ein Nukleotid deletiert (K3 und K7). Dies führte jeweils zu einer Verschiebung des Leserasters und resultierte in einem präterminalen Stop der Translation und einer Trunkierung des Proteins. Ebenso führte die Insertion von 22 bp in Exon 16 (K2) aufgrund der Verschiebung des Lesenrasters zu einem trunkierten Protein. Schließlich wurde ein Basenaustausch in einer hochkonservierten Donorspleißstelle analysiert, der zu einer in frame Deletion des Exon 13 führte (K1). Die subzelluläre Lokalisation mittels Immunfluoreszenzanalyse ergab für das ATP13A2-Wildtypprotein und alle PD-Mutanten eine Co-Lokalisierung mit dem lysosomalen Membranprotein LAMP2. Dagegen zeigten alle KRS-Mutationen eine subzelluläre Co-Lokalisierung mit dem endoplasmatischen Reticulum (ER). Da das ER maßgeblich an wichtigen Prozessen wie Faltung und Degradierung von Proteinen beteiligt ist, ist diese Fehllokalisation sehr wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass diese Mutanten von dem Organell als defizitär erkennt werden. Unterschiede zwischen den verschiedenen Mutationen bzw. Mutationstypen ließen sich auch hinsichtlich der Proteinstabilität feststellen. Während die PD-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp eine gleichbleibende Stabilität zeigten, waren die KRS-Mutanten weniger stabil. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die KRS-Mutanten nicht posttranslational modifiziert wurden, während für ATP13A2-WT und die PD-Mutanten eine N-Glykosylierung festgestellt wurde. Für alle hier untersuchten Proteine konnte gezeigt werden, dass sie durch das Proteasom degradiert werden. Allerdings scheint dies auf einem Ubiquitin-unabhängigen Weg zu erfolgen, der erst für wenige Proteine beschrieben worden ist. Es wurden demnach ausschließlich für die KRS-Mutationen Veränderungen der Proteineigenschaften bzw. Proteinlokalisation nachgewiesen, die vermutlich eine Reduktion der ATPasen-Funktion zur Folge haben und somit höchstwahrscheinlich einen pathogenen Effekt besitzen. Bei den so genannten PD-Mutationen konnte dies nicht gezeigt werden. Daher handelt es sich bei ihnen eher um Genvarianten, die eine neutrale Wirkung auf das Protein haben und somit nicht ursächlich am Krankheitsgeschehen beteiligt sind. Die zentrale Aufgabe des Lysosoms ist die Degradierung von Proteinen und Organellen. Da funktionelle Störungen dieses Kompartiments mehrfach mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden sind, sollte die Bedeutung von ATP13A2 für die Autophagie anhand von Fibroblasten eines KRS-Patienten untersucht werden. Es konnte jedoch keine offensichtliche Beteiligung an diesem Abbaumechanismus gezeigt werden. Des Weiteren kann ein gestörter Lipidmetabolismus zum Entstehen einer neurodegenerativen Erkrankung beitragen. Zusätzlich sind die nah verwandten P-Typ Typ IV ATPasen am Lipidtransport beteiligt. Daher wurde das Lipidprofil der KRS-Fibroblasten mit dem von Kontrollzellen verglichen. Auch hierbei wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Neben genetischen Aspekten tragen auch Umweltfaktoren, die zum Zellstress führen, zur Entstehung des Parkinsonismus bei. Diesbezüglich konnte für ATP13A2-defiziente Zellen im Vergleich zu Kontrollfibroblasten eine statistisch signifikant erhöhte Sensitivität gegenüber verschiedenen Formen des Zellstresses gezeigt werden, die auf einen möglichen molekularen Zusammenhang zwischen Umwelt-bedingten und genetischen Risikofaktoren hinweisen könnte. Die in vivo Analyse des Atp13a2-Gendefekts hinsichtlich Funktion und Bedeutung für die Pathogenese des KRS war bislang nicht möglich, da die Keimbahntransmission des rekombinanten Allels in unabhängig verfolgten Strategien nicht gelang.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Identification and characterisation of ATP13A2 variants and their relevance for neurodegenerative diseases English
Translated abstract:	Abstract Language Kufor-Rakeb syndrome (KRS) is a rare neurodegenerative disease. Beside characteristic features of Parkinsonism, patients additionally present symptoms like spasticity and dementia. In this autosomal recessive disease first symptoms appear at a young age. The genetic cause of KRS lies in biallelic mutations in ATP13A2 on chromosome 1p36. ATP13A2 codes for a P-type Type V ATPase with ten predicted transmembrane domains and a molecular weight of 135 kDa. Protein function as well as substrate specificity are still unknown. The aim of this work was to characterise described gene variants in ATP13A2 on a cellular level to better understand the pathogenesis of KRS and related forms of Parkinsonism. For analysing motor and cognitive disturbances in vivo, it was intended to additionally generate a knock-out mouse with constitutively deleted Atp13a2. All in all 15 different human mutations were analysed in vitro. While eight of them were identified in patients suffering from typical Parkinsonism (PD mutations), the other seven were found in KRS patients. Eleven mutations were caused by a missense exchange (P1-P8; K4-K6). However, there is no hint that the relevant change of an amino acid has an impact on the conformation of the particular protein. Deletion of a single nucleotide was observed in two KRS patients (K3 and K7), resulting in a shift of the open reading frame, which in turn led to a premature stop of translation and finally to protein truncation. The same truncating effect was observed for a mutation where 22 bp were additionally inserted in exon 16 (K2). Finally, a change of a nucleotide in a highly conserved donor splice site led to an in frame deletion of exon 13 (K1). The subcellular localisation by immunofluorescence analysis revealed for ATP13A2 wild-type protein and all PD mutants a co-localisation with the lysosomal membrane protein LAMP2. In contrast, all KRS mutants showed co-localisation with the endoplasmic reticulum (ER), which is involved in important cellular processes like folding and degradation of proteins. Thus, it is likely that the mislocalisation of the mutants correlates with detecting them as deficient. Further differences among the mutations and types of mutation were found regarding protein stability. While PD mutants showed a similar stability as the wild type protein, the KRS mutants were less stable and no posttranslational modification was detected. Contrary to that finding, ATP13A2 wild type and the PD mutants were N-glycosylated. All investigated proteins are degraded by the proteasome, which seems to happen in an ubiquitin-independent manner. This has so far been reported only for a few proteins. Consequently, changes in protein properties and protein localisation were only found for the KRS mutants, which probably reduce the function of the ATPase and hence exert a pathogenic effect. This could not be shown for the PD mutants. Therefore, these are rather gene variants with a neutral impact on the protein, which are not causative for developing the disease. The central role of the lysosome is degradation of proteins and organelles. As functional disturbances of this compartment have repeatedly been associated with neurodegenerative disorders, the involvement of ATP13A2 in autophagy was analysed in fibroblasts of a KRS patient. However, no obvious participation in this degradation pathway was observed. Furthermore, a dysfunctional lipid metabolism can contribute to neurodegenerative diseases. Additionally, closely related P-type type IV ATPases are involved in lipid transport. In view of this fact, the lipid profile of KRS fibroblasts was compared to that of control cells. But, once again, no significant differences were found. Beside genetic aspects also environmental factors which result in cellular stress contribute to developing Parkinsonism. It could be shown that ATP13A2-deficient cells show a higher sensitivity towards different forms of cell stress compared to control fibroblasts. This may point to a molecular connection between environmental and genetic risk factors. The in vivo analysis of the Atp13a2 gene defect regarding function and relevance for KRS pathogenesis has not been possible so far, because germline transmission of the recombinant allele has not been successful by independent strategies. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Heimbach, André andre.heimbach@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-30042
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Neurodegeneration, ATP13A2, Kufor-Rakeb Syndrom German Neurodegeneration, ATP13A2, Kufor-Rakeb Syndrome English
Date of oral exam:	11 January 2010
Referee:	Name Academic Title Hoppe, Thorsten Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3004