Universität zu Köln

Hauser, Christoph (2021). Neue Assays zur Charakterisierung der Transamidaseaktivität und der GTP-Bindungsfunktion von Transglutaminase 2. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Transglutaminase 2 (TGase 2), auch Gewebstransglutaminase genannt, gehört zur Familie der Transglutaminasen und bewirkt eine calciumabhängige Transamidierung zwischen proteingebundenen Glutaminylresten und vielfältigen primären Aminen. Zu diesen zählen proteingebundene Lysinreste sowie niedermolekulare Polyamine wie Cadaverin. Über diese namensgebenden Funktion hinaus, führt TGase 2 Deamidierungen proteingebundener Glutaminylreste aus. Neben diesen katalytischen Funktionen ist TGase 2 an Adhäsion-vermittelnden Protein-Protein-Interaktionen sowie an Signalweiterleitungsaktivitäten, unter anderem im Rahmen G-Protein-Funktion beteiligt. TGase 2 wird konstitutiv im ganzen Körper exprimiert und reguliert physiologischerweise unter anderem Apoptose und Wundheilung. TGase 2 wird darüber hinaus mit vielfältigen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, darunter Zöliakie, Fibrosen, diverse neurodegenerative Erkrankungen sowie Krebs. Dabei steht lediglich bei letzterem die Signalweiterleigungsfunktion im Vordergrund, während bei den anderen Krankheiten die Transamidasefunktion der TGase 2 im Fokus steht. Die vorliegende Arbeit umfasst den Aufbau eines prokaryotischen Expressionssystems humaner TGase 2 und die Entwicklung zweier Fluoreszenzanisotropie-basierten, hochdurchsatzfähigen Assayverfahren zur Quantifizierung der Transamidaseaktivität sowie der GTP-Bindungsfunktion. Der Transamidaseassay wurde dabei initial mit TGase 2 aus Meerschweinchenleber, dem gängigsten Modellenzym humaner TGase 2, etabliert und später auf rekombinante humane TGase 2 angewendet. Die Entwicklung umfasste dabei die Synthese dreier teils neuartiger fluoreszenzmarkierter Cadaverine durch die Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Reik Löser vom Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Substraten und Enzym, die Validierung mittels literaturbekannter Hemmstoffe, die Quantifizierung der Calciumabhängigkeit der Enzymaktivität sowie die Untersuchung einer Substanzbibliothek aus Nε-Acryloyl-lysinpiperaziden hinsichtlich ihrer Hemmung der Transamidaseaktivität von TGase 2. Der entwickelte Assay wurde darüber hinaus auf vier weitere Transglutaminasen übertragen und ausgewählte Hemmstoffe hinsichtlich ihrer Selektivität für TGase 2 hin untersucht. Schließlich erfolgten Demonstrationen der Tauglichkeit des Assays für Hochdurchsatzverfahren sowie zur Bestimmung der aktiven Enzymkonzentration. Der GTP-Bindungsassay wurde in Ermangelung eines literaturbekannten Modells direkt mit rekombinanter humaner TGase 2 etabliert. Die Entwicklung dieses Assays umfasste dabei die Synthese neuartiger fluoreszenzmarkierter Liganden zur Bindung an die GTP-Bindungsstelle von humaner TGase 2, die Charakterisierung der Bindungsstärke dieser Sonden, die Validierung durch literaturbekannter Hemmstoffe, eine Quantifizierung der Calciumabhängigkeit der GTP-Bindung humaner TGase 2 sowie die Synthese und Untersuchung einer Substanzbibliothek aus Analoga von Guanosindi- und triphosphat hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität zu humaner TGase 2. Schließlich erfolgten Untersuchung zur Tauglichkeit für Hochdurchsatzverfahren. Sämtliche Synthesen bezüglich des GTP-Bindungsassays wurden dabei dankenswerterweise durch die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Jacek Jemielity von der Universität Warschau durchgeführt.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Transglutaminase 2 (TGase 2) or tissue transglutaminase is a member of the transglutaminase enzyme family and catalyzes transamidation reactions between protein-bound glutaminyl residues and multiple primary amines in a calcium-dependent manner. These primary amines consist of protein-bound lysine residues as well as low-molecular-weight polyamines such as cadaverine. Besides this eponymous function, TGase 2 also catalyzes the deamidation of protein-bound glutaminyl residues. However, TGase 2 not only possesses catalytic activities and is also involved in adhesion-promoting protein-protein-interactions as well as in signal transduction, particularly in its function as G-protein. TGase 2 is constitutively expressed in the whole human body and regulates – besides others – apoptosis and wound healing. TGase 2 is associated with several diseases, i.e. coeliac disease, fibrosis, diverse neurodegenerative diseases and cancer with only the latter originating in the signal transduction function of TGase 2 whereas its transamidase activity being correlated the pathophysiology of the other disorders. The presented thesis provides the establishment of a procaryotic expression system of recombinant human TGase 2 and the development of two fluorescence anisotropy-based, high-throughput assays to quantify the transamidase activity as well as the GTP-bindung function of TGase 2. Initially, the transamidase assay was established using guinea pig liver-derived TGase 2 as the common model ezyme for human TGase 2 and was later applied to human TGase 2. The development of this assay consisted of the synthesis of three, in part novel, fluorescence-labeled cadaverins the characterization of the substrate-enzyme interactions, the assay validation using literature-known compounds, the quantification of the transamidase activity’s calcium-dependency as well as the investigation of a compound library of Nε-acryloyl-lysine piperazides regarding their potential to inhibit the transamidase activity of TGase 2. Furthermore, the newly developed assay was applied to four other members of the transglutaminase family and selected inhibitors were characterized regarding their selectivity for TGase 2 over the other transglutaminases. Finally, the assay’s suitability for a high-throughput screening was demonstrated and a method to determine the active enzyme concentration was described. All syntheses regarding the transamidase assay were conducted by members of the working group of by the group of Dr. Reik Löser, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, Institute of Radiopharmaceutical Cancer Research. The GTP-bindung assay was directly established with recombinant human TGase 2. The development consisted of the synthesis of novel fluorescence-labeled ligands for interaction with the enzyme’s GTP-binding site, the characterization of their respective binding affinity to human TGase 2, the validation using literature-known inhibitors, the quantification of the calcium-dependency of the GTP-binding event of human TGase 2 as well as the synthesis and analysis of a substance library of guanosindi- and triphosphate analogs. The studies concludes with an investigation of the suitability for a high-throughput screening. All sysntheses regarding the GTP-binding assay were conducted by members of the working group of Prof. Dr. Jacek Jemielity, Centre of New Technologies and the Division of Biophysics, Faculty of Physics, University of Warsaw. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hauser, Christoph christoph.hauser1@gmx.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-304487
Date:	18 January 2021
Language:	German
Faculty:	Central Institutions / Interdisciplinary Research Centers
Divisions:	Zentrum für Molekulare Medizin
Subjects:	Chemistry and allied sciences Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Transglutaminase; Assay; Fluoreszenzanisotropie; Transamidase; GTP-Bindung; Inhibitor German transglutaminase; assay; fluorescence anisotropy; transamidase; GTP binding; inhibitor English
Date of oral exam:	16 December 2020
Referee:	Name Academic Title Wagener, Raimund Prof. Dr. Neumaier, Bernd Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/30448