Investigating the role of papain-like cysteine protease RD21 in plant-pathogen interactions

Shindo, Takayuki (2010). Investigating the role of papain-like cysteine protease RD21 in plant-pathogen interactions. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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DCG-04 is a biotinylated derivative of cysteine protease inhibitor E-64, which irreversibly reacts with papain-like cysteine proteases (PLCPs) when these proteases are active. Using DCG-04, seven active proteases are labelled in Arabidopsis leaf extracts. Of these, RD21 (responsive to desiccation-21) was found to have increased activity during the infection with avirulent Pseudomonas syringe in Arabidopsis cell cultures. Infection with a virulent strain caused post-translational suppression of RD21 activity. These data suggest that RD21A plays a role in defence. We therefore challenged single, double and triple knock-out lines of RD21-like proteases with several pathogens and detected an altered susceptibility for Botrytis cinerea, but not the other pathogens tested. Presumably because adapted pathogens might use inhibitors that make them insensitive for RD21A. As an alternative reverse genetic approach, we silenced the RD21 orthologs of Nicotiana benthamiana using virus-induced gene silencing with Tobacco Rattle Virus (TRV)-based silencing vectors. NbRd21 silencing resulted in retarded growth and spreading cell death, most likely triggered by a combination of NbRd21 silencing and TRV presence. Interestingly, silencing of autophagy-related genes, ATG3 and ATG6, pheno-copied NbRD21 silencing. Furthermore, DCG-04 activity profiling assay showed the suppression of NbRD21 activity and up-regulation of NbRd21 transcript in ATG3 (and ATG6) silenced plants, which implies a connection between RD21, cell death and autophagy. To identify other defence-related PLCPs, we applied benzothiadiazole (BTH) to trigger the salicylic acid�regulated defence pathway in tomato. Of the seven PLCPs tested, transcription of only PIP1 and RCR3 were induced. Sequencing of PLCP alleles of tomato relatives revealed that same proteases, PIP1 and RCR3, are under diversifying selection, resulting in variant residues around the substrate binding groove. Taken together these data indicate that some PLCPs are involved in plant-pathogen interactions.

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Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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DCG04 ist ein biotinyliertes Derivat des Cysteinprotease Hemmstoffs E-64,welcher irreversible mit papainähnlichen Cysteinproteasen (PLCPs) reagiert, wenndiese in aktiver Form vorliegen. DCG-04 markiert sieben aktive Proteasen inArabidopsis Blattextrakten Eine dieser Proteasen, RD21 (Responsive to Desiccation-21),weist eine erhöhte Aktivität während einer avirulent Pseudomonas syringae-Infektion inArabidopsis- Zellkulturen auf. Eine Infektion mit einem virulenten PseudomonasStamm führte hingegen zu einer post- translationalen Unterdrückung der RD21Aktivität, was vermuten lässt, dass RD21 eine Rolle in der Pathogenabwehr spielt. Umdiese Vermutung zu belegen, haben wir Einfach-, Doppel-und Dreifach-Knockoutmutanten der RD21- ähnlichen granulierten Proteasen verschiedenenPathogenen ausgesetzt. Dabei stellten wir fest, dass sich unter diesen Bedingungen nurdie Anfälligkeit gegenüber Botrytis cinerea verändert hat, vermutlich weil angepasstePathogene Hemmstoffe nutzen, um gegenüber RD21 weniger anfällig zu sein. Um die Rolle von RD21 in N. benthamiana zu klären, haben wir diegenetisch-rückwärtsgerichtete Methode des Virus- induzierten Silencing (VIGS) mit aufdem Tobacco Rattle Virus (TRV)-basierenden silencing Vektoren vonRD21-orthologen Genen durchgeführt. Dabei konnten wir beobachten, dass dasUnterdrücken von NbRD21 zu unterentwickeltem Wuchs und sich ausbreitendemZelltod führt, und vermuten, dass diese Reaktion höchstwahrscheinlich durch eineKombination von RD21A-Unterdrückung und dem Vorhandensein desSilencing-Vektor TRV ausgelöst wurde. Interessanterweise hat das Unterdrücken derGene ATG3 und ATG6, die eine Rolle bei der Autophagie spielen, den gleichenEinfluss auf die phenotypische Entwicklung von Nb wie das Silencing von RD21.Zusätzlich konnte anhand von aktivitätsbezogenen Untersuchungen mit DCG04 eineneine klare Verminderung des RD21-Signals in Pflanzen, in denen die Expression vonATG3 und ATG6 unterdrückt ist, nachgewiesen werden, wobei das Transkriptionslevelder Cysteinprotease erhöht ist. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass eindeutlicher Zusammenhang zwischen NbRd21, Zelltod und Autophagie besteht. Um darüberhinaus weitere abwehrverwandten PLCPs zu identifizieren, nutzenwir Benzothiadiazol (BTH), um den Salizylsäure-regulierten Abwehrmechanismus inTomate einzuleitet. Von sieben getesteten PLCPs wurde nur die Transkription von PIP1und RCR3 induziert. Die Sequenzierung von PLCP-Allelen verwandter Species zeigte,dass diese Proteasen, PIP1 und RCR3 unter Selektionsdruck stehen, was sich imAuftreten unterschiedlicher Aminosäuren um die Substratbindestelle herumwiederspiegelt. Letztlich weisen diese Ergebnisse stark daraufhin, dass einige PLCPseine Rolle in Pflanzen-Pathogen Interaktionen besitzen

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