Division site selection in B. subtilis and characterization of YpbR, a bacterial dynamin

Baarle, Suey van (2009). Division site selection in B. subtilis and characterization of YpbR, a bacterial dynamin. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Cell division in Bacillus subtilis takes place precisely at midcell through the action of Noc, which prevents division from occurring over the nucleoids, and the Min system, which prevents cell division from taking place at the poles. Originally it was thought that the Min system acts directly on FtsZ, preventing the formation of a Z ring, and therefore the formation of a complete cytokinetic ring at the poles. Recently, a new component of the B. subtilis Min system was identified, MinJ, which acts as a bridge between DivIVA and MinCD. By using time lapse microscopy, it is shown here that MinJ moves from the poles to midcell prior to septation, and after this process is completed, moves back to the poles. This indicates that its main site of action is at midcell. Additionally, in the absence of a functional Min system, FtsA remains at the poles instead of being disassembled, which subsequently forms a double ring leading to minicell formation. Late divisome proteins FtsL and PBP-2B are also not disassembled from completed division sites. Previously it was described that FtsL and PBP-2B fail to localize in the absence of MinJ, which seems to lead to the filamentous phenotype of DminJ cells. In this thesis it was shown that this is due to dispersed MinCD, since in a DminCDJ mutant GFP-PBP-2B and GFP-FtsL localize to midcell again, although they are also found at the poles. MinJ mutants were isolated that are able to complement the cell length phenotype of DminJ cells, but lead to an increased production of minicells, showing that in cells expressing these mutants cytokinesis is not impaired but division site selection is. Additionally, it was shown that overexpression of MinD in the absence of MinJ leads to lethal filamentation in B. subtilis, although cytoplasmic components of the cytokinetic ring are able to localize in these cells. In the absence of a functional Min system, cells contain multiple FtsA rings, indicating an impairment in cell division efficiency. Taken together, these results show that i) the Min system is involved in the disassembly of the divisome, rather than preventing its assembly at the poles, which also explains its preferential localization to midcell prior to septation, ii) the failure to disassemble the divisome leads to minicell formation, iii) the Min system is needed for efficient cell division, and iv) MinJ is able to regulate MinCD activity, possibly by restricting its activity to certain sites. Using a bacterial two-hybrid screen, it was found that MinJ interacts with YpbR. YpbR is a large protein containing two GTPase domains and shows homology to the dynamin-like proteins. Although YpbR does not appear to be important for growth, morphology, or sporulation, it was shown that cells deficient in YpbR are less susceptible to antibiotics than wild type. Also, under salt stress, DypbR cells show an altered morphology of septa. This indicates that YpbR probably plays a role in stabilizing the membrane under conditions that impart stress to the lipid membrane. YpbR-GFP is localized to the membrane and forms foci, but when cells are exposed to high concentrations of NaCl, YpbR-GFP forms a uniform structure on the membrane. Also, the first GTPase domain alone (GTPase1) is able to localize in a similar pattern as wild type and forms a uniform structure on the membrane under salt stress, but the second GTPase domain is diffuse throughout the cell. Using mutants that are unable to hydrolyze GTPase with the first GTPase domain (K56A) or the second (K625A), it was shown that the localization to the membrane and subsequent change of localization under salt stress is not dependent on the GTP binding. Under normal conditions, YpbR-GFP and YpbR mutant proteins are found mostly in the membrane fraction but also somewhat in the cytoplasmic fraction, but under salt stress all of the proteins are found mostly in the membrane fraction. It was also shown that YpbR-GFP localizes to spores early in sporulation and its overexpression increases sporulation efficiency. It is postulated that YpbR is mostly involved in stabilizing the membrane or involved in membrane dynamics, but is not essential in B. subtilis.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Zellteilungsauswahl in B. subtilis und Characterisierung von YpbR, ein Bacterielles Dynamin	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Bacillus subtilis Zellen teilen sich exakt in der Zellmitte. Dass die Zellteilung nicht im Bereich des Chromosoms erfolgt, wird dabei von Noc gewährleistet, während das Min-System verhindert, dass Teilung nicht an den Polen stattfindet. Dabei wurde zunächst angenommen, dass das Min-System direkt die Polymerisation von FtsZ inhibiert und so die Entstehung des Z-Rings und die Bildung des kompletten zytokinetischen Rings an den Polen inhibiert. Es konnte allerdings eine neue Komponente des Min-Systems identifiziert werden, MinJ, welche als Verbindung zwischen DivIVA und MinCD fungiert. Unter Verwendung von Zeitreihen-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass MinJ bereits vor Beginn der Zellteilung in der Zellmitte lokalisiert und nach Abschluss der Teilung wieder an den Polen akkumuliert. Dies weist darauf hin, dass der Hauptwirkungsort für MinJ die Zellmitte ist. Des weiteren konnte hier gezeigt werden, dass ohne ein funktionales Min-System FtsA an den Polen verbleibt, was die Entstehung eines Doppelrings und somit die Entstehung von Minizellen zur Folge hat. Auch die Komplexe aus den späten Zellteilungsproteinen FtsL und PBP-2B werden ohne ein funktionales Min-System nicht an der Zellteilungsebene aufgelöst. Unter Verwendung einer MinJ-Deletionsmutante wurde bereits herausgefunden, dass FtsL und PBP-2B nicht korrekt lokalisieren können, was zur Entstehung von filamentösen Zellen führt. In dieser Arbeit wurde zusätzlich gezeigt, dass dies auf die unspezifische Lokalisation von MinCD zurückzuführen ist, da sich in einer ΔminCDJ-Mutante PBP-2B-GFP und FtsL-GFP sowohl in der Zellmitte als auch an den Polen wiederfanden. Es wurden MinJ-Mutanten isoliert, die in der Lage waren, den Zelllängen-Phänotyp von ΔminCDJ-Mutanten zu komplementieren, dabei allerdings eine erhöhte Produktion von Minizellen zeigten. Diese Mutanten sind also in der toplogischen Regulation der der Zellteilung beeinträchtigt, nicht aber in der Zytokinese per se. Zusätzlich führt die Überexpression von MinD in Abwesenheit von MinJ zu einem letalen, filamentösen Phänotyp in B. subtilis, obwohl die zytoplasmatischen Komponenten, wie FtsA, des zytokinetischen Rings korrekt lokalisieren. Zusammenfassend bedeutet dies, dass das Min-System für die effektive Durchführung der Zellteilung benötigt wird. Es ist eher an der Auflösung des Zellteilungs-Divisoms beteiligt, als dass es ihre Lokalisation an den Polen verhindert, was durch die bevorzugte Konzentration in der Zellmitte kurz vor der Zellteilung gezeigt wurde. Wird das Divisom nach erfolgter Zellteilung allerdings nicht aufgelöst, entstehen Minizellen. Letztlich wird die Aktivität von MinCD, wahrscheinlich durch dessen lokale Beschränkung, durch MinJ reguliert. Unter Verwendung eines bakteriellen Zwei-Hybrid-Systems konnte eine Interaktion von MinJ mit YpbR gezeigt werden. YpbR ist ein großes Protein mit zwei GTPase-Domänen, das Ähnlichkeit zu Dynamin aufweist. Obwohl YpbR nicht an Wachstum, Morphologie oder Sporulation beteiligt ist, zeigten sich YpbR-Deletionsmutanten weniger empfindlich gegenüber bestimmten Antibiotika im Vergleich zum Wildtyp. Unter Salzstress zeigten diese Mutanten eine veränderte Morphologie der Teilungssepten. Dies ist ein Indiz dafür, dass YpbR möglicherweise unter Stressbedingungen stabilisierend auf die Membran wirkt. Während YpbR-GFP unter physiologischen Bedingungen punktuell an der Membran lokalisiert, bildet es unter hohem Salzstress eine uniforme Struktur an der Membran aus. Die erste GTPase-Domäne (GTPase 1) folgt unter Salzstress diesem Muster, im Gegensatz dazu bleibt die zweite GTPase-Domäne über die Zelle verteilt. Untersuchungen mit Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren, GTP mit der ersten (K56A) oder der zweiten GTPase-Domäne (K625A) zu binden, zeigten, dass die Lokalisation an die Membran und die veränderte Lokalisation unter Salzstress nicht von der GTPase-Aktivität abhängig ist. Während die YpbR-GFP und YpbR-Mutanten unter physiologischen Bedingungen überwiegend in der Membranfraktion aber auch in der zytoplasmatischen Fraktion zu finden waren, akkumulierten diese unter Salzstress vorwiegend in der Membranfraktion. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass YpbR-GFP im frühen Sporulationsstadium an den Sporen lokalisiert und eine Überexpression zu verstärkter Sporulation führt. Es wird daher postuliert, dass YpbR vorwiegend in die Stabilisierung der Membran bzw. Membrandynamik involviert ist, allerdings nicht essentiell für B. subtilis ist.

German

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