Universität zu Köln

Schenková, Kristína (2010). Characterisation of atypical Rho GTPases of the RhoBTB family and their binding partners. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

RhoBTB proteins constitute a subfamily of atypical Rho GTPases represented by three isoforms in vertebrates. They serve as adaptors in the formation of Cul3-dependent ubiquitin ligase complexes. Although reports about the function of RhoBTB proteins are accumulating, their significance in cellular processes is far from being understood. Using markers for different subcellular compartments we examined the localisation of RhoBTB3 and found that this protein is localised in part at the GA and to a less extent at early endosomes. Overexpression of RhoBTB proteins significantly disrupted the GA morphology. Disruption of the microtubule, but not of the actin, network caused delocalisation of RhoBTB3 positive vesicles. Connecting to previous observations from our laboratory, we investigated more deeply the function of RhoBTB3 in multiprotein Cul3-dependent ubiquitin ligase complexes. Using immunoprecipitation we observed that RhoBTB3 interacts with endogenous Cul3 and is ubiquitinated by Cul3-dependent ubiquitin ligase complexes for subsequent degradation in the proteasome. This degradation is prevented by an intramolecular interaction between the GTPase domain and the C-terminus of RhoBTB3. We confirmed that RhoBTB proteins, similarly to other adaptors involved in Cul-dependent degradation, are able to dimerise and this interaction is not mediated by Cul3. We propose a model in which RhoBTB proteins play roles in targeting of substrates for ubiquitination and degradation via Cul3-dependent ubiquitin ligase complexes. In order to identify binding partners (and possible substrates) of RhoBTB3 a two-hybrid screening on a mouse brain cDNA library was performed previously in our laboratory. We confirmed the interactions with three potential binding partners, namely MUF1, kindlin-2 (that we further extended also to kindlin-1) and Uev1a by co-immunoprecipitation and co-localisation studies. We focused on MUF1, a largely uncharacterised protein that consist of a leucine-rich repeat region and a BC-box that serves as a linker in multicomponent, Cul5-based ubiquitin ligases. We found that MUF1 interacts with all three RhoBTB proteins and that the interaction between MUF1 and RhoBTB3 is direct and does not depend on Cul3 and Cul5. MUF1 localises in the nucleus but RhoBTB3 causes it to be partially retained in the cytoplasm where both proteins co-localise. MUF1 is able to make homodimers, a feature shared by many leucine-rich repeat containing proteins, and this homodimerisation is not mediated by Cul5. RhoBTB is an adaptor of Cul3-based ubiquitin ligases and MUF1 is an adaptor of Cul5-based ubiquitin ligases. This raises the question whether MUF1 and RhoBTB3 are together involved in multiprotein complexes containing Cul3 and Cul5 simultaneously. It has been reported that cullins can assemble into dimers, and consistent with this, we found that Cul3 and Cul5 are able to heterodimerise. Our results suggest that MUF1 is degraded in the proteasome in a Cul5 independent manner by a Cul3-RhoBTB3 ligase complex. Our data shows that there is extensive cross-talk among cullin-dependent ubiquitin ligases. We envision a model in which MUF1 exists in a Cul5-ubiquitin ligase complex and predominantly regulates turnover of nuclear proteins by targeting them to the proteasome. RhoBTB3 may be able to regulate MUF1 functions by targeting it for proteasomal degradation in the cytoplasm.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Charakterisierung der atypischen Rho GTPasen der RhoBTB Familie und deren Bindungspartner German Characterisation of atypical Rho GTPases of the RhoBTB family and their binding partners English
Translated abstract:	Abstract Language Die RhoBTB Proteine gründen eine Unterfamilie der atypischen Rho GTPasen und kommen in Vertebraten in drei Isoformen vor. Sie wirken ursprünglich als Adaptoren am Aufbau von Cul3-abhängigen Ubiquitin Ligase Komplexen. Obwohl es mittlerweile viele Berichte zu den Funktionen der RhoBTB Proteine gibt, ist ihre Bedeutung in zellulären Prozessen bislang kaum geklärt. Wir haben die subzelluläre Lokalisation von RhoBTB3 mit Hilfe von Markern für unterschiedliche subzelluläre Kompartimente untersucht und zeigen, dass RhoBTB3 teilweise am GA und in kleinerem Umfang an frühen Endosomen lokalisiert ist. Die Überexpression der RhoBTB Proteine führt zu signifikanten Störungen in der GA-Morphologie. Störungen des Mikrotubuli-, nicht aber des Aktinnetzwerks führten zu einer Delokalisation von RhoBTB3 positiven Vesikeln. Anknüpfend an frühere Beobachtungen unseres Labors, haben wir die Funktion von RhoBTB3 im Multiprotein Cul3-abhängiger Ubiquitin Ligase Komplexe genauer untersucht. Mit Hilfe von Immunopräzipitionsstudien haben wir bestätigt, dass RhoBTB3 mit endogenem Cul3 interagiert und vom Cul3-abhängigen Ubiquitin Ligase Komplex für den darauffolgenden Abbau im Proteasom ubiquitiniert wird. Dieser Abbau wird durch intramolekulare Wechselwirkungen zwischen der GTPase Domäne und dem C-Terminus von RhoBTB3 verhindert. Wir konnten bestätigen, dass RhoBTB Proteine dimerisieren können, vergleichbar mit anderen Adaptoren die am Cul-abhängigen Abbau beteiligt sind. Dieser Vorgang wird nicht von Cul3 vermittelt. Wir schlagen ein Modell vor, bei dem RhoBTB Proteine an der Markierung von Substraten für eine Ubiquitinierung und am Abbau durch Cul3-abhängige Ubiquitin Ligase Komplexe beteiligt sind. Um Bindungspartner (und potenzielle Substrate) von RhoBTB3 zu identifizieren, wurde in unserem Labor bereits früher ein two-hybrid screening mit einer cDNA Bibliothek aus murinem Gehirn durchgeführt. Wir konnten eine Wechselwirkung zu drei potenziellen Bindungspartnern durch Koimmunopräzipitations- und Kolokalisationsstudien bestätigen: MUF1, kindlin-2 (wir erweiterten es später zusätzlich auf kindlin-1) und Uev1a. Wir haben den Schwerpunkt auf MUF1 gelegt, ein kaum charakterisiertes Protein, dass aus einer leucinreichen Wiederholungsregion und einer BC-Box besteht, die als Verbindungsstelle in multikomponenten Cul5 basierenden Ubiquitin Ligasen dient. Wir bestätigten die Interaktion zwischen MUF1 und allen drei RhoBTB Proteinen, und konnten zeigen, dass eine direkte Interaktion zwischen MUF1 und RhoBTB3 auftritt, die nicht von Cul3 und Cal5 abhängt. MUF1 lokalisiert im Kern, wobei es von RhoBTB3 im Zytoplasma zurück gehalten wird, indem beide Proteine kolokalisieren. Wir konnten beobachten, dass MUF1 in der Lage ist Homodimere zu bilden - eine Eigenschaft, die es mit vielen Proteinen, die leucinreiche Wiederholungen enthalten ,teilt. Diese Homodimerisation wird nicht von Cul5 vermittelt. RhoBTB ist ein Adaptor der Cul3-basierenden Ubiquitin Ligasen und MUF1 ein Adaptor der Cul5-basierenden Ubiquitin Ligasen. Dies führt zu der Frage, ob MUF1 und RhoBTB3 zusammen in Multiproteinkomplexen, die sowohl Cul3 als auch Cul5 enthalten, involviert sind. Es wurde berichtet, dass sich Culline zu Dimeren zusammenfügen können. Übereinstimmend damit fanden wir heraus, dass Cul3 und Cul5 in der Lage sind Heterodimere zu bilden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MUF1 im Proteasom in einer Cul5-unabhängigen Weise von einem Cul3 RhoBTB3 Ligase Komplex abgebaut wird. Dies deutet auf ein umfangreiches Zusammenspiel zwischen den Cullin-abhängigen Ubiquitin Ligasen untereinander hin. Wir stellen uns ein Modell vor, in dem MUF1 in einem Cul5-abhängigen Ubiquitin Ligase Komplex eingebunden ist, und hauptsächlich den turnover der Zellkernproteine beeinflusst, indem es sie für das Proteasom markiert. RhoBTB3 wäre in der Lage die Funktionen von MUF1 zu regulieren, indem RhoBTB3 MUF1 für den Abbau im Proteasom im Zytoplasma markiert. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Schenková, Kristína kristinka_sch@yahoo.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-31618
Date:	2010
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language MUF1, RhoBTB, cullin German MUF1, RhoBTB, cullin English
Date of oral exam:	29 June 2010
Referee:	Name Academic Title Noegel, Angelika Anna Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3161