Universität zu Köln

Engqvist, Martin (2010). Characterization of three 2-hydroxy-acid dehydrogenases in the context of a biotechnological approach to short-circuit photorespiration. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Photorespiration results from the incorporation of oxygen into ribulose-1,5-bisphosphate due to the failure of RuBisCO to properly discriminate between oxygen and carbon dioxide. This process lowers photosynthetic efficiency in that CO2 and ammonia should be re-assimilated with the concomitant consumption of both ATP and reducing power. Two recent approaches, aimed at decreasing the detrimental effects of photorespiration by introducing novel metabolic pathways into plant chloroplasts, show great promise. The goal of this work was to identify and biochemically characterize a single-gene glycolate dehydrogenase for use in further improving the synthetic pathways. Forward and reverse genetics were used to identify three candidate genes in Arabidopsis thaliana; At5g06580, At4g36400 and At4g18360. The proteins encoded by these genes were expressed in Escherichia coli, purified and characterized. Moreover, in silico analysis and the analysis of loss-of-function mutants yielded insights into the significance of these novel enzymatic activities in plant metabolism. AtD-LDH, encoded by At5g06580, is a homodimeric FAD-binding flavoprotein that catalyzes the cytochrome c- dependent oxidation of substrates. The enzyme has high activity with D- and L-lactate, D-2-hydroxybutyrate and D-glycerate, but of these only D-lactate and D-2-hydroxybutyrate are bound with high affinity. Knock-out mutants show impaired growth on medium containing methylglyoxal and D-lactate. Together, the data indicates a role for AtD-LDH in the mitochondrial intermembrane space where it oxidizes D-lactate to pyruvate in the final step of methylglyoxal detoxification. AtD-2HGDH, encoded by At4g36400, is a homodimeric FAD-binding flavoprotein. The enzyme only has activity with D-2-hydroxyglutarate and uses a synthetic electron acceptor in vitro. Metabolic analysis of knock-out mutants reveals high accumulation of D-2-hydroxyglutarate in plants exposed to long periods of extended darkness, confirming that this is the in vivo substrate for the enzyme. Co-expression analysis reveals that AtD-2HGDH is co-expressed with enzymes and transporters participating in the breakdown of lipids, branched-chain amino acids and chlorophyll, all pathways that converge in the production of propionyl-CoA. Together, the data suggest a role for AtD-2HGDH in the mitochondrial matrix where it oxidizes D-2-hydroxyglutarate, most probably originating from propionyl-CoA metabolism, to 2-oxoglutarate, using an electron transfer flavoprotein as an electron acceptor. Finally, AtGOX3, encoded by At4g18360, is a peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase with specificity towards glycolate, L-lactate and L-2-hydroxybutyrate. AtGOX3 is almost exclusively expressed in roots where it might participate in either the metabolism of L-lactate produced during hypoxia, or glycolate produced from glycolaldehyde. In this work, the identification and thorough characterization of three novel enzymatic activities in the model plant A. thaliana are described. Moreover, novel plant metabolic pathways in which these enzymes participate were discovered. The biochemical characterization of these enzymes indicated that they are not suited for use in pathways aimed at decreasing photorespiration and thus, the search for a single-gene glycolate dehydrogenase should continue.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Kohlenstofffixierung der Photosynthese wird durch das Enzym Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase katalysiert. Sauerstoff und Kohlenstoffdioxid konkurrieren um die katalytische Stelle des Enzyms. Da die Oxygenaseaktivität, eine Verlustreaktion darstellt, gibt es technische Ansätze zur Reduzierung der mit der Photorespiration verbundenen Verluste. Zwei Strategien, mit dem Ziel die energetisch ineffizienten Effekte der Photorespiration durch das Einbringen neuer Stoffwechselwege in den Chloroplasten zu vermindern sind vielversprechend. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und biochemische Charakterisierung einer Glykolat Dehydrogenase für weitere Untersuchungen und Verbesserungen dieser Stoffwechselwege. �Forward� und �reverse� Genetik wurde verwendet, um drei Gene in Arabidopsis thaliana zu identifizieren; At5g06580, At4g36400 und At4g18360. Diese Gene wurden in Escherichia coli kloniert und das rekombinante Protein exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Weiterhin gaben in silico Analysen und die Untersuchung von Mutanten Einblicke in die physiologische Relevanz dieser Gene. AtD-LDH, welches durch At5g06580 kodiert wird, ist ein homodimeres FAD-bindendes Flavoprotein, welches die Cytochrom C-abhängige Oxidation von Substraten katalysiert. Dieses Enzym zeigt eine hohe Aktivität mit D- und L-Lactat, D-2-Hydroxybutyrat und D-Glycerat, von denen jedoch nur D-Lactat und D-2-Hydroxybutyrat mit hoher Affinität gebunden werden. Deletionsmutanten zeigen sowohl auf Medium mit Methylglyoxal und D-Lactat, als auch auf Medium mit D-2-Hydroxybutyrat ein beeinträchtiges Wachstum. Die Daten deuten eine Rolle der AtD-LDH im mitochondrialen Intermembranraum an, wo es im finalen Schritt der Methylglyoxal Entgiftung D-Lactat zu Pyruvat oxidiert. AtD-2HGDH, welches durch At4g36400 kodiert wird, ist ebenfalls ein homodimeres FAD-bindendes Flavoprotein. Dieses Enzym zeigt nur mit D-2-Hydroxyglutarat Aktivität und nutzt in vitro einen künstlichen Elektronenakzeptor. Metabolische Analysen der Deletionsmutanten dieses Gens zeigen eine hohe Akkumulation von D-2-Hydroxyglutarat in Pflanzen, welche einer längeren Dunkelphase ausgesetzt waren. Dies deutet darauf hin, dass es sich in vivo bei diesem Molekül um das Substrat der AtD-2HGDH handelt. Co-Expressionsanalysen zeigen wichtige Enzyme und Transporter, welche am Abbau von Fetten, verzweigte Aminosäuren und Chlorophyll beteiligt sind. Zusammengefasst zeigen die Daten eine Rolle der AtD-2HGDH in der mitochondrialen Matrix, wo sie D-2-Hydroxyglutarat, welches vermutlich aus dem Propionyl-CoA Metabolismus stammt, zu 2-Oxoglutarat oxidiert. Als letztes Gen wurde At4g18360, welches für AtGOX3 kodiert, untersucht. Hierbei handelt es sich um eine peroxisomale (S)-2-Hydroxysäure Oxidase mit einer Spezifität für Glykolat, L-Lactat und L-2-Hydroxybutyrat. AtGOX3 wird nahezu ausschließlich in Wurzeln exprimiert, wo es entweder an dem Abbau von L-Lactat während einer Hypoxie oder an dem Abbau von Glykolat stammend aus Glykolaldehyd beteiligt sein könnte. Die vollständige biochemische Charakterisierung dieser Enzyme, zeigt dass sie nicht für den Gebrauch in Stoffwechselwegen zur Verminderung der Photorespiration geeignet sind. Die Suche nach einer funktionellen Glykolat Dehydrogenase wird weiter fortgesetzt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Engqvist, Martin martin_engqvist@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-32128
Date:	2010
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language 2-hydroxyglutarate , laktat , 2-hydroxy-säure , dehydrogenase , photorespiration German 2-hydroxyglutarate , lactate , 2-hydroxy-acid , dehydrogenase , photorespiration English
Date of oral exam:	1 June 2010
Referee:	Name Academic Title Flügge, Ulf-Ingo Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3212