Universität zu Köln

Zietek, Tamara (2009). Etablierung der Peptid-Aptamertechnologie zur Modifikation des Carotinoid-Stoffwechsels in Pflanzen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

In der vorliegenden Arbeit galt es, mithilfe der Peptid-Aptamer-Technologie ausgewählte Schlüsselenzyme des pflanzlichen Carotinoid-Stoffwechsels funktionell zu beeinflussen und so eine Anreicherung von Beta-Carotin zu erzielen. Als Zielenzyme wurden hierfür die drei plastidär lokalisierten Enzyme Phytoensynthase, Beta-Ring-Hydroxylase 2 und Lycopen-Epsilon-Cyclase aus dem Modellorganismus Arabidopsis thaliana ausgewählt. Nach Etablierung eines geeigneten bakteriellen Testsystems zur Carotinoid-Biosynthese konnten Funktion und Aktivität dieser Zielenzyme in E. coli eindeutig verifiziert werden. In Koexpressions-Experimenten kam es zu Zielprotein-abhängigen Verschiebungen der Carotinoid-Profile, und die entsprechenden Stoffwechselendprodukte wurden mittels Color-Complementation-Assay (Farbänderung der transgenen Bakterien) und HPLC-Analytik detektiert. Die Verwendung der funktionell charakterisierten Zielenzyme als Baits in Yeast-Two-Hybrid-Screenings führte zur erfolgreichen Identifikation spezifischer, interagierender Peptid-Aptamere aus verschiedenen Zufallspeptid-Libraries. Deren mögliche bioaktive Wirkung auf das jeweilige Zielenzym wurde in Koexpressions-Experimenten im bakteriellen Testsystem überprüft. Via HPLC-Analytik konnten so Aptamer-abhängige Veränderungen der Carotinoid-Metaboliten-Verhältnisse mit hoher Sensitivität detektiert und eindeutig nachgewiesen werden. Für das Zielenzym Lycopen-Epsilon-Cyclase (EC) wurde das 16 AS lange, bioaktive Aptamer 25Q6 mit stark inhibitorischer Wirkung identifiziert. Im Falle der Beta-Ring-Hydroxylase (BH2) wurde für 21 Aptamere ein vermutlich inhibierender Einfluss auf eine der beiden enzymatisch katalysierten Teilreaktionen nachgewiesen. Transiente Genexpressions- und BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation)-Studien in Nicotiana benthamiana bewiesen zweifelsfrei die funktionelle Expression und Interaktion von EC und 25Q6 in planta. Weitere Untersuchungen zur chloroplastidären Expression des 25Q6-Aptamers in transgenen Arabidopsis-Linien dienten der Bestimmung seiner bioaktiven Wirkung in Pflanzenzellen. Unter Verwendung des 35S-Promotors, des ChloroP-Transitpeptids und des Fluoreszenzmarkers CFP als Aptamer-Fusionsprotein konnte in transgenen Arabidopsis-Linien nur eine sehr schwache rekombinante Aptamer-Expression festgestellt werden. Die gewünschte chloroplastidäre Lokalisation konnte nicht nachgewiesen werden. Es wurden nicht aptamerspezifische, phänotypische Veränderungen der transgenen Pflanzenlinien festgestellt, die vermutlich durch CFP verursacht wurden. Zur funktionellen Charakterisierung der drei Zielgen-Promotoren wurden die vollständigen intergenischen upstream-Regionen transkriptionell mit dem GUS-Reportergen fusioniert und die Promotoraktivitäten über GUS-Expression in transgenen Arabidopsis-Linien hinsichtlich Stärke und Gewebe- bzw. Organspezifität analysiert. Alle drei Promotoren waren in A. thaliana aktiv, wobei sich die Expressionsstärken und -muster deutlich unterschieden. Eine verkürzte Variante des PSY-Promotors, bei der ein Teil des PSY-5'-UTRs und des ersten Introns fehlten, zeigte keine Reporter-Expression. Die Promotoren wurden desweiteren in transienten GUS-Expressionsanalysen in Früchten der Nutz- und Zielpflanze Tomate (Solanum lycopersicum) untersucht. Auch in dem heterologen System waren alle drei Promotoren aktiv und zeigten verschiedene Expressionsprofile. Der verkürzte PSY-Promotor war auch in den Tomatenfrüchten nicht aktiv.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Establishment of the peptide aptamer technology for modification of plant carotenoid content English
Translated abstract:	Abstract Language In order to change metabolic fluxes towards increased beta-carotene synthesis three central enzymes of the plant carotenoid pathway were selected as targets for modification of the enzymatic activity via binding of bioactive peptide aptamers: phytoene synthase, lycopene-epsilon-cyclase and beta-ring hydroxylase from Arabidopsis thaliana. To prove functionality of these enzymes we performed complementation studies employing an assay based on transgenic E. coli capable of producing carotenoids. Coexpression of the active target enzymes led to changes in carotenoid metabolism and distribution, which was detected by a color complementation assay (visible shift of the colony-color) as well as by HPLC analysis. Yeast-Two-Hybrid screenings were performed using random peptide libraries and the three target enzymes as baits for identification of peptide aptamers. A functional in vivo assay in carotenoid producing E. coli was used to screen specifically interacting aptamers for their bioactive properties by coexpressing the aptamer and interacting target enzyme. Aptamers influencing the target enzyme activity were detected by changes in the carotenoid metabolic profile via HPLC analysis. The 16 amino acid bioactive aptamer 25Q6 was shown to strongly inhibit lycopene-epsilon-cyclase (EC) activity. 21 aptamers were found to specifically inhibit one of the two reactions catalyzed by beta-ring hydroxylase. Transient expression of aptamer 25Q6 and A. thaliana EC as well as their interaction by bimolecular fluorescence complementation assay in planta were confirmed in Nicotiana benthamiana. Due to plastid localization of all three target enzymes, transgenic Arabidopsis lines were generated expressing 25Q6 peptide targeted to the chloroplasts. Using the 35S-promoter, the chloroplast localized CFP-aptamer fusion protein showed only weak recombinant expression and proper localization could not be detected. Phenotypic changes of the transgenic lines compared to A. thaliana WT were observed, but obviously not due to aptamer-specific effects. For functional analysis of the endogenous promoters of the three target genes the intergenic regions upstream the genes were cloned. In addition, an alternative shorter fragment of PSY promoter was selected partially lacking the 5'UTR and the first intron of the PSY gene. In order to verify promoter strength and tissue specificity A. thaliana plants were transformed with reporter constructs containing GUS under control of the cloned promoter sequences. All three full length promoters showed to be active in A. thaliana, whereas expression patterns strongly varied. The shorter variant of PSY promoter was inactive. Additionally, transient GUS expression analysis was performed to prove activity of the three A. thaliana promoters in the heterologous system tomato (Solanum lycopersicum). Transient transformation of tomato fruits showed reporter expression levels were quite comparable to those of the A. thaliana experiments, while the shortened PSY promoter again was inactive. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zietek, Tamara zietek@tum.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-32786
Date:	2009
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Carotinoid-Stoffwechsel , Peptid-Aptamere , Protein-Interaktionen , Functional Food , Pflanzen-Biotechnologie German carotenoid metabolism , peptide aptamers , protein interactions , functional food , plant biotechnology English
Date of oral exam:	4 February 2010
Referee:	Name Academic Title Uhrig, Joachim PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3278