Universität zu Köln

Reiss, Martina (2011). Characterization of Sirt2 using conditional RNAi in mice. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Within the past eight years, RNA interference (RNAi) has emerged as a powerful experimental tool for gene function analysis in mice. Reversible control of shRNA mediated RNAi has been achieved by using a tetracycline (tet)-inducible promoter. In the presence of the inductor doxycycline (dox), shRNA mediated gene silencing is initiated, whereas RNAi mechanism is blocked in the absence of dox. To achieve spatially and temporally regulated RNAi, the tet inducible system was combined with a Cre/loxP based strategy for tissue specific activation of shRNA constructs. To this end, a loxP-flanked "promoter inhibitory element" (PIE) was placed between the proximal (PSE) and distal sequence element (DSE) of a dox inducible promoter such that promoter function is completely blocked. Re-activation can be achieved through Cre mediated excision of PIE. To allow for gene silencing in a selected tissue, Cre expression can be regulated by a tissue-specific promoter. In mouse ES cells, the system mediated tight regulation of shRNA expression upon Cre mediated activation and dox administration, reaching knockdown efficiencies of >80%. Unexpectedly, the system showed a limited activity in transgenic mice when applied for conditional silencing of two different targets, LacZ and Sirt2. Sirt2 is a member of the sirtuin family which has considerably gained attention in vitro for its possible role in many physiological processes, including adipogenesis and neurodegenerative diseases. To investigate the function of Sirt2 in vivo, the unmodified dox-responsive and tet-inducible promoter was further used for conditional RNAi in transgenic mice. Inducible shRNA expression resulted in efficient silencing of Sirt2 (>90%) in all tissues which have been analyzed. Suppression of Sirt2 during embryogenesis resulted in offspring consisting of equal ratios of wild type and transgenic pups, indicating that Sirt2 is not indispensable for development. In adult animals, glucose metabolism, insulin sensitivity and energy balance appeared to be unaffected by Sirt2 deficiency. Likewise, expression of PPARγ, a downstream target of Sirt2, was not found to be altered upon Sirt2 inhibition. Finally, Sirt2 silencing was induced in an experimental model of Parkinson disease (PD). Data from Rotarod performances to study motor behaviour did not provide any evidence for a role of Sirt2 in PD pathogenesis as suggested by previous in vitro studies. Taken together, conditional Sirt2 silencing in vivo does not support speculation concerning a central role of Sirt2 in physiological processes, embryogenesis and in a mouse model of Parkinson disease.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language In den letzten acht Jahren hat sich die RNA Interferenz (RNAi) zu einer äußerst effizienten Methode entwickelt, um Funktionen von Genen in Mäusen zu untersuchen. Eine Regulierung der shRNA Transkription und des RNAi-Mechanismus wurde durch die Entwicklung von tet-induzierbaren Promotoren erreicht. In Gegenwart des Induktors Doxyzyklin (dox) findet aktiv shRNA Transkription statt, welche RNAi auslöst und zu einer Verringerung der Genexpression führt. In Abwesenheit von dox ist der RNAi-Mechanismus blockiert. Um RNAi gewebespezifisch und zeitlich regulieren zu können, wurde das tet-induzierbare System mit der Cre/loxP Technologie kombiniert. Dazu wurde ein loxP-flankiertes "Promotor inhibitorisches Element" (PIE) zwischen das proximale (PSE) und distale (DSE) Sequenzelement des dox-induzierbaren Promotors platziert, wodurch dessen Aktivität vollständig blockiert wurde. PIE kann durch Cre-Rekombination entfernt werden, sodass die Promotorfunktion wiederhergestellt wird. Es besteht die Möglichkeit, Cre durch einen gewebespezifischen Promotor zu regulieren, womit der "Knockdown" gezielt in einem spezifischen Gewebe stattfindet. In embryonalen Mausstammzellen konnte mit diesem System die shRNA Expression nach Aktivierung durch Cre und Induktion mit dox reguliert werden. Die Genepression konnte dabei bis zu mehr als 80% herunterreguliert werden. In transgenen Mäusen war der "Knockdown" von zwei verschiedenen Zielgenen, LacZ und Sirt2, unerwartet gering. Sirt2 wurde äußerst interessant, nachdem es mit grundlegenden physiologischen Prozessen wie Lipogenese und neurodegenerativen Erkrankungen in vitro in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von Sirt2 in vivo zu untersuchen, wurde das nicht-gewebespezifische und durch dox induzierbare tet-Promotor-System für induzierbare RNAi in Mäusen genutzt. Dabei führte die shRNA Transkription in allen untersuchten Geweben zu einer effizienten Herunterregulierung der Sirt2-Expression (>90%). Ein "Knockdown" von Sirt2 während der Embryogenese hatte keine Auswirkung auf den Anteil der Wildtyp- und transgenen Nachkommen, was vermuten lässt, dass sich ein Verlust von Sirt2 während der Embryogenese nicht lethal auswirkt. In ausgewachsenen Tieren schienen Glukosemetabolismus, Insulinsensitivität und Energiebilanz nicht durch ein Sirt2 Defizit beeinflusst zu werden. Die Expression von PPARγ, einem "Downstream"-Target von Sirt2 war ebenfalls nicht durch einen Sirt2-"Knockdown" verändert. Abschließend wurde die Funktion von Sirt2 in einem Parkinson-Krankheitsmodell untersucht. Ergebnisse aus Rotarod-Studien, die dazu dienen motorische Fähigkeiten zu analysieren, ließen keinen Aufschluß über eine Rolle von Sirt2 in der Krankheitsentstehung von Parkinson zu. Insgesamt unterstützt ein Sirt2-"Knockdown" in vivo keine Spekulationen bezüglich einer zentralen Rolle von Sirt2 bei physiologischen Prozessen, in der Embryogenes und in einem Mausmodell der Parkinson-Krankheit. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Reiss, Martina mreiss@smail.uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-32865
Date:	2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language RNAi, Sirt2, Doxyzyklin, induzierbar German RNAi, Sirt2, doxycycline, inducible English
Date of oral exam:	10 January 2011
Referee:	Name Academic Title Brüning, Jens C. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3286