Universität zu Köln

Keusekotten, Kirstin (2010). Targeting SUMO conjugates for degradation: The human RING finger RNF4 as a specialized ubiquitin ligase. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Ubiquitin and the small ubiquitin related modifier (SUMO) belong to a group of small proteins that can be covalently attached to lysine side chains of other proteins, thereby changing their function, localization, interaction partners or stability. The conjugation reactions are mediated by an enzymatic cascade of specific activating, conjugating and ligating enzymes. A ubiquitin chain of at least four K48-linked ubiquitin molecules target substrate proteins for degradation by the proteasome. Several interconnections exist between the ubiquitin and SUMO system, with the latest discoveries made in yeast by identifying E3 ubiquitin ligases that target SUMO conjugates for ubiquitylation and subsequent degradation by the proteasome. These ubiquitin ligases for SUMO conjugates (ULS) recognize especially high molecular weight SUMO conjugates, probably modified with SUMO chains. In mammals, out of the three conjugatable SUMO paralogs, only SUMO-2/3 are able to form chains. Upon stress induction, the free pool of SUMO-2/3 is rapidly conjugated to cellular target proteins. These conjugates are under proteasomal control, implicating that the ULS pathway is conserved in humans. This work identified the RING finger protein RNF4 as a human ULS protein, confirming previous observations in which RNF4 complemented yeast ULS deletion phenotypes. RNF4 comprises a RING domain which is present in many E3 ligases and a stretch of up to four SUMO interaction motifs (SIMs) that confer binding to SUMO. In order to demonstrate ULS activity for RNF4, an in vitro ubiquitylation assay for SUMO conjugates has been developed. For that purpose, SUMOylated proteins were generated and purified as in vitro substrates from E. coli. RNF4 efficiently in vitro ubiquitylated SUMO modified PML while unmodified PML was not recognized as a substrate. This result is in line with recent studies in cells demonstrating that RNF4 targets PML in a SUMO-dependent manner after arsenic trioxide treatment, a drug which is applied in acute promyelocytic leukemia (APL). By investigating the SUMO binding properties of the RNF4 SIM domain, it became apparent that the interaction was especially enhanced by the presence of SUMO chains of more than two SUMOs. In addition, a SIM type specific recognition was noticed for different SUMO paralogs, which emphasizes the idea that there is also a SUMO paralogs specific regulation. Finally, in an attempt to find other ULS regulated cellular proteins, an RNF4 SIM domain construct was used to isolate poly- or multi-SUMOylated proteins from cells subjected to diverse cell stresses.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Den Abbau von SUMO-Konjugaten als Ziel: das humane RING Finger Protein RNF4 als spezialisierte Ubiquitin-Ligase German
Translated abstract:	Abstract Language Die zwei verwandten Proteine Ubiquitin und SUMO gehoeren zu einer Gruppe kleiner Proteine, die kovalent an die Seitenketten von Lysinen anderer Proteine (Substrate) konjugiert werden koennen. Dies kann zu Veraenderungen der Proteinfunktion, -lokalisation, -interaktion oder -stabilitaet fuehren. Die Konjugation erfolgt ueber spezifische Enzymkaskaden von aktivierenden, konjugierenden und ligierenden Enzymen. Ubiquitin-Ketten, die ueber K48 geknuepft werden, dienen als Signal fuer den proteasomalen Abbau von Substratproteinen. Die Ubiquitin- und SUMO-Systeme sind auf vielerlei Art miteinander verbunden, wobei die neueste Entdeckung in der Hefe zur Identifizierung spezialisierter Ubiquitin E3-Ligasen fuehrte. Diese ubiquitylieren SUMO-modifizierte Proteine und bewirken dadurch deren proteasomalen Abbau. Diese sogenannten Ubiquitin-Ligasen fuer SUMO-Konjugate (ULS) erkennen vor allem hochmolekulare SUMO-Konjugate, die wahrscheinlich mit SUMO-Ketten modifiziert sind. In Saeugern sind von den drei konjugierbaren SUMOs nur SUMO-2 und -3 in der Lage, Ketten auszubilden. Freie SUMO-2/3-Molekuele werden durch mehrere Arten von Zellstressen relativ schnell an Substrate konjugiert. Diese Konjugate stehen unter proteasomaler Kontrolle, was darauf schließen laesst, dass der ULS-Abbauweg bis zum Menschen konserviert ist. In dieser Arbeit konnte das RING-Finger Protein RNF4 als humanes ULS-Protein identifiziert werden. Dies bestaetigte vorangegangene Beobachtungen, in denen RNF4 die Deletionsphaenotypen von Hefe-ULS-Proteinen komplementiert. RNF4 enthaelt eine fuer viele E3-Ligasen typische RING-Domaene sowie einen Bereich von bis zu vier SUMO-Interaktionsmotiven (SIMs), welche die Bindung an SUMO ermoeglichen. Um die ULS-Aktivitaet von RNF4 eindeutig zeigen zu koennen, wurde ein in vitro-Versuch entwickelt, in dem SUMO-Konjugate ubiquityliert werden. Dazu wurden gereinigte SUMO-modifizierte Proteine benoetigt, die in E. coli hergestellt wurden. RNF4 ubiquityliert effizient und spezifisch SUMO-modifiziertes PML, waehrend nicht-modifiziertes PML nicht ubiquityliert wird. Dieses Ergebnis wird durch aktuelle Studien bestaetigt, in denen gezeigt wurde, dass RNF4 nach Arsentrioxid (ATO)-Zugabe den SUMO-abhaengigen Abbau von PML induziert. ATO wird zur Behandlung der akuten promyelozytischen Leukaemie eingesetzt. Untersuchungen der SUMO-bindenden Eigenschaften des SIM-haltigen RNF4-Bereichs zeigten, dass RNF4 bevorzugt an SUMO-Ketten mit mindestens zwei SUMO-Molekuelen bindet. Zusaetzlich wurde eine unterschiedliche SIM-Typ-Praeferenz verschiedener SUMOs festgestellt, was die Frage nach einer SUMO-spezifischen Regulation aufwirft. Schließlich wurde der SIM-haltige Bereich von RNF4 dazu eingesetzt, poly- oder multi-SUMOylierte Proteine als potentielle ULS-Substrate aus Zellen zu isolieren, die zuvor verschiedenen Stressarten ausgesetzt wurden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Keusekotten, Kirstin kkeuseko@smail.uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-33044
Date:	2010
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language RNF4 , ULS , SUMO , SIM , PML English
Date of oral exam:	6 June 2010
Referee:	Name Academic Title Langer, Thomas Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3304