Universität zu Köln

Garbes, Lutz (2010). Histone deacetylase inhibitors for the epigenetic therapy of proximal spinal muscular atrophy. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die proximal spinale Muskelatrophie (SMA) ist charakterisiert durch eine fortschreitende Degeneration der a-Motoneuronen in the Vorderhörnern des Rückenmarks. Sie wird durch den homozygoten funktionellen Verlust des survival motor neuron Gens 1 (SMN1) verursacht. Allerdings konnte gezeigt werden, dass alle SMA-Patienten zumindest über eine Kopie des SMN2-Genes verfügen. Während SMN1 ausschließlich Volllängen-Transkripte (FL-SMN) produziert, sind 90% aller SMN2 Transkripte alternativ gespleißt. Ihnen fehlt das Exon 7 (SMN2D7), was zu einem instabilen Protein führt. Zwar reicht die Menge and SMN2 Volllängenprotein nicht aus um für den Verlust von SMN1 zu kompensieren, andererseits beeinflusst es jedoch den SMA Phänotyp: Über je mehr SMN2 Kopien ein SMA Patient verfügt, desto milder ist der Krankheitsverlauf. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Histon Deacetylase Inhibitoren (HDACi) einerseits das SMN2 Gen aktivieren und darüberhinaus auch sein Spleißmuster korregieren. Eine Pilotstudie mit SMA-Patienten, die mit dem HDACi VPA behandelt wurden, ergab jedoch ein recht unterschiedliches Bild. In knapp einem Drittel der Patienten ist die Menge an FL-SMN2 im Blut, wie erhofft, angestiegen. In einem weiteren Drittel jedoch konnte keine Änderung festgestellt werden, wohingegen im letzten Drittel die Menge an FL-SMN2 durch VPA-Gabe sogar reduziert war. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Suche nach den Ursachen, aufgrund derer SMA-Patienten nicht positiv auf VPA reagieren. Von allen SMA-Patienten, die an der Pilot-Studie teilgenommen hatten, wurden Fibroblasten Linien aus Hautstanzen etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass in mehr als 60% der Fälle beide Gewebe, Blut wie Fibroblasten, gleichermaßen auf VPA ansprachen. Um zu verstehen, warum SMN2 nicht durch VPA in Non-Respondern aktiviert wird, wurden Chromatin-Immunopräzipitationen (ChIP) durchgeführt. Es zeigte sich, dass das SMN Protein in Non-Respondern unter VPA-Behandlung nicht ansteigt, da VPA nicht zu einer SMN2 Promotor Hyperacetylierung führt. Um die Frage nach den Gründen hierfür zu beantworten, wurde die Transkriptome von Pos- und Non-Responder Fibroblasten mittels Mikro-Array verglichen. Die Auswertung der Daten zeigte, dass in den Non-Respondern kein einziges Transkript differentiell unter VPA-Behandlung exprimiert wurde. Interessanterweise wurden lediglich neun Gene gefunden, die signifikant unterschiedlich zwischen unbehandelten Pos- and Non-Respondern exprimiert wurden. Basierend auf publizierten Daten wurden die Gene Cluster of Differentiation (CD36), IGF-binde Protein 5 (IGFBP5), Retinoic Acid Receptor b (RARb) und Transforming Growth Factor a (TGFa) für weitere Experimente ausgewählt. CD36 und RARb sind beide in Non-Respondern höher exprimiert, wohingegen höherer Menge von IGFBP5 und TGFa in Pos-Respondern gefunden wurden. Da CD36 ein Fettsäuretransporter ist, wurden ebenfalls massenspektroskopische Versuche zur Aufnahme und Metabolisierung von VPA durchgeführt. Eine differentielle Verstoffwechslung von VPA als Ursache für das Auftreten Non-Respondern konnte jedoch ausgeschlossen werden. Ausgehend von diesen Daten wurde die generelle Fettsäureaufnahme von Fibroblasten verglichen. Diese Daten lassen vermuten, dass CD36 zumindest in Fibroblasten eher als Fettsäureexporter denn als -importer fungiert. Ferner konnten wir den HDACi LBH589 und sein strukturell nah verwandtes Derivat JnJ-26481585 als potentielle SMA-Therapeutika identifizieren, die einem enormen Effekt auf die SMN-Protein Menge haben. So stieg die SMN Menge bis zu 10-fach bei LBH589 Konzentration von 400 nM beziehungsweise 1 uM an. Ein höherer Anstieg wurde bis dato noch nicht publiziert. ChIP-Analyse des SMN2 Promoters, sowie die Messung der SMN2 Promotoraktivität in einer Reporterzelllinie, zeigten, dass am SMN2 Promoter HDAC-Inhibition und Promoter-Aktivität in einer 1:1 Stöichiometrie korrelieren. Es wurde eine EC50 von 108 nM LBH589 bestimmt. Auf RNA-Ebene konnten wir zeigen, dass LBH589 einerseits die SMN Expression steigert, aber auch das Spleißmuster durch Hoch-Regulation des Spleißfaktors hTRA2-b1, welcher den Einbezug des SMN2 Exons 7 fördert, revertiert. Mittels Präzipitations-Experimenten konnten wir zeigen, dass die Ubiquitinylierung von SMN stark reduziert ist. Ursächlich hierfür ist vermutlich eine verstärkte SMN-Komplex Bildung, die dann zu einer Anreicherung von SMN im Laufe der Zeit führt. Wir konnten zeigen, dass LBH589 in humanen NSCs wie auch in MEFs von SMA-Mäusen SMN Protein hochreguliert. Abschließend wurden LBH589 subkutan in Mäuse injiziert um zu untersuchen, ob sich eine in vivo Untersuchung von LBH589 anbietet. Die Analyse von Gewebeextrakten aus dem ZNS zeigte, dass die Menge an SMN Protein im Gehirn steigt und gleichermaßen auch die Histonacetylierung zunahm. Daher sollten LBH589, bzw. auch JnJ-26481585, in einer größer angelegten Studie im SMA-Tiermodell untersucht werden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Histonedeacetylase-Inhibitoren für die epigenetische Therapie der proximalen spinalen Muskelatrophie German
Translated abstract:	Abstract Language Proximal spinal muscular atrophy (SMA) is characterized by the progressive degeneration of the a-motor neurons in the anterior horns of the spinal cord. It is caused by homozygous functional absence of the survival motor neuron gene 1 (SMN1). Though, all SMA patients retain at least one copy of the nearly identical copy gene SMN2 - but this gives predominantly rise to an unstable protein. But even though the amount of fully functional SMN2 protein is not sufficient to compensate for the loss of SMN1, it has been shown that SMN2 is the major disease modifying gene: The more SMN2 a SMA patient has, the less severe is the phenotype. Self-evident, SMN2 became the major target for potential SMA therapy. It has been demonstrated that epigenetic therapy by applying histone deacetylase inhibitors (HDACi) activates SMN2 transcription and modulates SMN2 splicing by inducing splice factor expression. However, in a pilot clinical trial with the short-chain fatty acid HDACi valproic acid (VPA), the response to the treatment was quite diverse. Around 1/3 of SMA patients exhibited increased FL-SMN2 levels in blood. In contrast, in another 1/3 no response was detected, while in the remaining 1/3 SMN levels were even decreased. In the present work, the crucial factors determining VPA non-responsiveness were investigated. Fibroblast lines from all SMA patients included in the pilot clinical trial were established and treated with VPA. By western blot analysis, we were able to show that the response to VPA correlates between fibroblasts and blood in over 60%. To get a deeper insight into the reason why SMN2 is not induced in Non-Responders, we performed chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis and could demonstrate that VPA does not trigger SMN2 promoter hyperacetylation in Non-Responder fibroblast lines. To identify the crucial factors, fibroblasts of both Pos- and Non-Responders were compared by differential micro-array analysis. Data analysis revealed that in the Non-Responders no single gene was differentially expressed after VPA treatment, indicating that VPA is generally not acting as an HDACi. Furthermore, only nine genes were detected to be differentially expressed between untreated Pos- and Non-Responders, suggesting that these may be a predisposing set-up. After validation by qRT-PCR, the four candidates cluster of differentiation (CD36), IGF-binding protein 5 (IGFBP5), retinoic acid receptor b (RARb) and transforming growth factor a (TGFa) were selected based on literature research. While CD36 and RARb showed a higher expression in Non-Responders, elevated levels of IGFBP5 and TGFa were detected in Pos-Responders. In order to identify the cause of differential expression, all four genes were sequenced in both Pos- and Non-Responders and the respective promoters were analysed by ChIP. Since CD36 is involved in LCFA transport, VPA uptake and metabolism were analyzed by HPLC-MS/MS. In summary, we could exclude that VPA is differentially metabolized between Pos- and Non-Responders. Futhermore, LCFA uptake in fibroblasts was measured using a fluorescent labeled fatty-acid analogue. Interestingly, these data suggest that in fibroblasts CD36 is rather functioning as a fatty acid exporter than an importer. Furthermore, we identified the second generation HDACi LBH589 as well as its derivate JnJ-26481585 as compounds tremendously increasing SMN levels. At concentrations of 400 nM and 1 uM LBH589, up to 10-fold increased SMN amounts were recorded, which is the highest induction reported so far. Analysis of the SMN2 promoter by ChIP as well measurement of the SMN2 promoter activity using a reporter cell line revealed a 1:1 stoichiometry between HDAC inhibition and expression rate with an EC50 of approx. 108 nM. On RNA level, we could demonstrate that LBH589 increases SMN expression, but also reverses the SMN2 splice pattern by up-regulation of hTRA2-b1, a splice factor promoting SMN2 exon 7 inclusion. We were able to show that, most likely through enhanced complexation, ubiquitinylation of SMN is reduced, thus leading to a SMN accumulation over time. Moreover, by treating murine embryonic fibroblasts (MEF) and neural stem cells (NSC) from epilepsy surgeries we could prove that LBH589 is also active in both the neural and the murine context. In addition, as a first step towards an in vivo evalution, mice were sub-cutaneously injected with LBH589. Using tissue extracts, we could demonstrate that LBH589 increases both SMN protein and histone acetylation in central nervous system. Based on these convincing results, LBH589 and JnJ-26481585 were proposed for extended in vivo testing in SMA-like mice to evaluate their therapeutic potential. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Garbes, Lutz lutz.garbes@uk-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-33111
Date:	2010
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language SMA , Epigenetik , HDAC-Inhibitoren , VPA , LBH589 German SMA , Epigenetic , HDAC inhibitors , VPA , LBH589 English
Date of oral exam:	21 November 2010
Referee:	Name Academic Title Wirth, Brunhilde Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/3311