Untersuchungen zu Eintrittsmechanismen des Herpes simplex Virus Typ 1 in Keratinozyten und Epidermis

Petermann, Philipp (2011). Untersuchungen zu Eintrittsmechanismen des Herpes simplex Virus Typ 1 in Keratinozyten und Epidermis. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

Preview

PDF
Disputation_Philipp_Petermann.pdf
Download (10MB)

Abstract

Keratinozyten der Mukosa, Haut und Kornea stellen die primäre Eintrittspforte für Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1) in den Wirtsorganismus dar. Das zentrale Interesse dieser Arbeit bestand darin, zu verstehen, wie HSV-1 die Barrierefunktion der Epithelien überkommt und welche molekularen Mechanismen dem Viruseintritt zugrunde liegen, um die Infektion in Keratinozyten erfolgreich zu etablieren. Zunächst wurde die Initiation der HSV-1 Infektion in Keratinozyten untersucht. Ausgehend von der Hypothese, dass die Dynamik der Zellbeweglichkeit und Adhäsion den Viruseintritt beeinflussen können, wurde die Rolle der Rac1-/Cdc42-Signaltransduktion analysiert. Die Rho GTPasen Rac1 und Cdc42 sind zentrale Regulatoren der Aktin-Dynamik. Es zeigte sich, dass die frühe HSV-1 Infektion in der Keratinozyten-Zelllinie HaCaT zu einer temporären Veränderung der Aktivitätszustände von endogenem Rac1 und Cdc42 führte. Wenn konstitutiv aktives Rac1 oder Cdc42 vor der Infektion transient überexprimiert wurde, reduzierte sich die Anzahl infizierter Zellen, wohingegen dominant negatives Rac1 keinen Effekt hatte. Die Abhängigkeit der HSV-1 Infektion von endogenem Rac1 und Cdc42 sollte daher durch RNA Interferenz-Analysen überprüft werden. Nach Reduktion von endogenem Rac1 und/oder Cdc42 wurde sowohl in HaCaT-Zellen als auch in humanen primären Keratinozyten kein Effekt auf die Initiation der viralen Genexpression beobachtet. Zur weiteren Analyse wurde murine Epidermis, deren Keratinozyten kein endogenes Rac1 exprimierten, ex vivo infiziert. Ähnlich wie in den Kontroll-Tieren wurden auch in der Abwesenheit von Rac1 die basalen Keratinozyten in der Epidermis infiziert. Daher kann der Schluss gezogen werden, dass die Initiation der HSV-1 Infektion von Keratinozyten nicht von der Rac1-/Cdc42-Signaltransduktion abhängig ist und konstitutiv aktives Rac1 und Cdc42 das Potential haben mit der frühen HSV-1 Infektion zu interferieren. Zur weiteren Charakterisierung des Eintrittsmechanismus von HSV-1 in Keratinozyten wurde zuerst die Internalisierung der Viruspartikel elektronenmikroskopisch untersucht. Dabei wurden sowohl Kapside im Zytoplasma als auch umhüllte Viruspartikel in Vesikeln beobachtet. Interessanterweise waren in den humanen primären Keratinozyten im Gegensatz zu den HaCaT-Zellen mehr umhüllte Viruspartikel in Vesikeln als Kapside im Zytoplasma zu finden. Diese Ergebnisse weisen auf eine Internalisierung durch Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran und auf eine endozytotische Aufnahme hin. Wenn die GTPase-Aktivität von Dynamin2 durch den Inhibitor Dynasore gehemmt wurde, konnten beide Internalisierungswege nicht mehr beobachtet werden. EM-Aufnahmen zeigten stattdessen Viruspartikel an invaginierten Stellen der Plasmamembran. Die Behandlung mit Dynasore führte nicht nur in Keratinozyten zu einer Inhibition der Infektion, sondern hemmte auch die ex vivo Infektion muriner Epidermis. Diese Daten legen erstmals eine Beteiligung von Dynamin an der Internalisierung von HSV-1 in Keratinozyten nahe. Um der Bedeutung einer endozytotischen Virusaufnahme nachzugehen, wurden Inhibitor- und Kolokalisierungsstudien durchgeführt. Die Hemmung der Endosomen-Ansäuerung durch Ammoniumchlorid ergab eine konzentrationsabhängige Reduktion von infizierten Zellen. Weiterhin wurde die Kolokalisierung von Viruspartikeln mit frühen Endosomen, nicht aber mit Lysosomen, beobachtet. Diese ersten Ergebnisse deuten die Beteiligung eines endozytotischen Aufnahmeweges an. Um die Barrierefunktion des Epithels zu verstehen, wurden ex vivo Infektionsstudien in Haut- und Epidermisstücken durchgeführt. Das Ziel war es zunächst den initialen Eintrittsweg in das Gewebe zu charakterisieren. Wenn murine Haut in Virussuspension inkubierte, wurden keine infizierten Zellen beobachtet. Erst nach Trennung der Epidermis von der Dermis mit Hilfe von DispaseII wurden infizierte basale Keratinozyten gefunden. Wenn die Epidermis durch EDTA-Behandlung abgetrennt wurde, war allerdings keine Infektion nachweisbar. Das ex vivo Infektionsmodell wurde auch für humane orale Schleimhaut etabliert. Ähnlich zu dem murinen Gewebe wurden basale Keratinozyten in isolierter Epidermis infiziert, nicht aber komplette Schleimhautstücke. Wenn die Schleimhautstücke vor Infektion mechanisch verwundet wurden, konnten infizierte Zellen entlang der Verwundungslinie beobachtet werden. Die Anzahl der infizierten Zellen erhöhte sich, wenn die verwundeten Schleimhautstücke vor Infektion in Keratinozyten-Medium inkubiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass basale Keratinozyten infiziert werden können, sobald diese durch DispaseII-Behandlung für das Virus zugänglich waren. Erste Verwundungsstudien deuten an, dass der Eintritt von HSV-1 in die humane Schleimhaut von der Zugänglichkeit zu nicht-differenzierten bzw. sich in der Differenzierung-befindlichen Keratinozyten abhängt.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Analyses of herpes simplex virus type 1 entry mechanisms in keratinocytes and epidermis	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Mucosal, epidermal and corneal keratinocytes represent the primary entry portal for herpes simplex virus type 1 (HSV-1) during infection of its human host. The longterm goal is to understand how HSV-1 overcomes the barrier function of the epithelia and on which molecular mechanisms virus entry depends to establish successful infection in keratinocytes. Firstly, putative determinants that contribute to HSV-1 infection were analysed. Based on the hypothesis that cell dynamics and adhesion affect the virus entry, the role of Rac1/Cdc42 signalling was examined. The Rho GTPases Rac1 and Cdc42 are key regulators of actin dynamics. Measurement of endogenous Rac1 and Cdc42 in the human keratinocyte cell line HaCaT demonstrated temporary changes in activity levels of Rac1/Cdc42 upon HSV-1 infection. Overexpression of Rac1/Cdc42 mutants in HaCaT cells showed that constitutively active Rac1 and Cdc42 mutants decreased infectivity while dominant negative Rac1 had no effect. Accordingly, RNA interference experiments were performed to explore whether HSV-1 infection was dependent on endogenous Rac1 and Cdc42. Silencing of endogenous Rac1 and/or Cdc42 in HaCaT cells and human primary keratinocytes had no effect on the number of infected cells. To further investigate the role of Rho GTPases, ex vivo infection studies were performed in murine epidermis lacking Rac1. Similar to the control littermates, the lack of Rac1 led also to infection of basal keratinocytes. These results indicate that the initiation of HSV-1 infection in keratinocytes is not dependent on Rac1/Cdc42 signalling and that the constitutively active Rac1 and Cdc42 mutants have the potential to interfere with infectivity. To further characterise the entry mechanism of HSV-1 in keratinocytes, the internalisation of virus particles were examined by electron microscopy. The studies demonstrated both capsids underneath the plasma membrane and virus particles in vesicles. Interestingly, more virus particles in vesicles were observed in human primary keratinocytes as compared to HaCaT cells than capsids in the cytoplasm. The results suggest internalisation of HSV-1 by fusion with the plasma membrane as well as by endocytic vesicles. When the activity of Dynamin2 was inhibited by Dynasore both internalisation pathways were blocked. EM studies demonstrated virus particles at invagination sites of the plasma membrane. Furthermore, the treatment with Dynasore also blocked the ex vivo infection of murine epidermis. This is the first report indicating the involvement of Dynamin in HSV-1 internalisation into keratinocytes. To elucidate the importance of the endocytic pathway, inhibitor and co-localisation studies were performed. The inhibition of the acidification of endosomes by ammonium chloride demonstrated a concentration dependent reduction of infected cells. Furthermore, co-localisation of incoming viruses with early endosomes, but not with lysosomes was observed. These initial results point to an endocytic pathway. To understand the barrier function of the epithelia, ex vivo infection studies in skin/epidermis samples were performed. Here, we initiated studies to characterise the initial entry site into the epithelia. No infected cells were observed in intact murine skin. In contrast, murine epidermis that was separated from the dermis by dispaseII treatment demonstrated infected basal keratinocytes. Interestingly, no infected cells were visible after the separation of the epidermis with EDTA. The ex vivo infection assay was also established for human oral mucosa. Similar to murine skin, basal keratinocytes were only infected after separation of the epidermis from the dermis by dispaseII. Mechanical wounding of mucosa prior to infection resulted in infected keratinocytes near the lesion. Interestingly, incubation of wounded mucosa in keratinocyte-specific medium prior to infection increased the number of infected cells. The experiments indicate that HSV-1 initiates infection in basal keratinocytes once they are accessible by dispaseII treatment. Initial wounding experiments suggest that the entry of HSV-1 into human mucosa is dependent on the accessibility of non-differentiated and/or more-differentiated keratinocytes.

English

Creators: