Universität zu Köln

Busch, Jakob D. (2019). MitoRibo-Tag mice – a novel tool to study the composition of the mitochondrial ribosome in vivo. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mitochondria, semi-autonomous organelles of eukaryotic cells derived from an α-proteobacterium, are essential for synthesis of iron-sulfur clusters, amino acids, lipids and for maintaining the cellular ATP levels by the oxidative phosphorylation (OXPHOS). During evolution, mitochondria retained a compact double stranded circular mitochondrial DNA (mtDNA) genome, which harbors organelle-specific rRNA, tRNA and mRNA genes. The mitochondrial mRNAs encode highly hydrophobic protein constituents of the OXPHOS system and are translated by mitochondrial ribosomes (mitoribosomes). The coordinated synthesis of mtDNA- and nuclear- encoded OXPHOS proteins is required for mitochondrial integrity and cell survival. Mitoribosomes are structurally and functionally adapted as they have acquired 36 specific proteins, different from bacterial ribosomal proteins, and putatively interact with inner mitochondrial membrane. The regulation of translation and mitoribosome assembly in mitochondria is well studied in Saccharomyces cerevisiae but remains largely unexplored in mammals due to the limited number of available animal models. To obtain new insights into regulatory mechanisms underlying the process of mitochondrial translation, we generated a knock-in mouse model, denoted MitoRibo-Tag mice, expressing a FLAG-tagged mitoribosome protein. We used MitoRibo-Tag mice to determine the mitoribosome interactome across various mouse tissues by proteomics. This mitoribosome protein catalog unravels several novel mitoribosome-interacting proteins (MIPs) and demonstrates intriguing tissue-specific compositional differences. Moreover, the proteomic definition of a biogenesis intermediate, formed in the absence of the mitoribosome assembly factor MTERF4, unveils PUSL1 as a novel MIP. We find that PUSL1 is peripherally associated with the mitochondrial inner membrane from the matrix side and part of a yet unknown mitoribosome biogenesis intermediate. Additionally, depletion of PUSL1 reveals that the protein is required for efficient de novo synthesis of mtDNA-encoded proteins. In summary, this PhD thesis establishes MitoRibo-Tag mice as a novel tool to study mitoribosomes in vivo, enabling future studies on translation and dynamics during different physiological states, including ageing, exercise and fasting or disease.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language MitoRibo-Tag Mäuse – Ein neues Werkzeug zur Untersuchung der mitochondrialen Ribosomenzusammensetzung in vivo German
Translated abstract:	Abstract Language Mitochondrien sind semiautonome Organellen eukaryotischer Zellen α-proteobakteriellen Ursprungs, welche essentielle Eisen-Schwefel-Kofaktoren, Aminosäuren und Lipide synthetisieren. Ferner regulieren Mitochondrien das zelluläre Verhältnis von ATP zu ADP und Phosphat durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS). Trotz der evolutionären Entwicklung haben Mitochondrien ein kompaktes zirkuläres doppelsträngiges Genom, die mitochondriale DNA (mtDNA), behalten, welches organellenspezifische rRNA, tRNA und mRNAs kodiert. Mitochondriale mRNAs chiffrieren hydrophobe Kernproteine der OXPHOS, welche von mitochondrienspezifischen Ribosomen (Mitoribosomen) translatiert werden. Die koordinierte Synthese von mtDNA- und zellkernkodierten OXPHOS-Proteinen ist essentiell für die mitochondriale Integrität und das Überleben der Zelle. Mitoribosomen sind strukturell und funktionell angepasst, weil sie im Vergleich zu bakteriellen Ribosomen 36 zusätzliche Proteine erworben haben und mit der inneren mitochondrialen Membran interagieren. Die Biogenese von Mitoribosomen ist überwiegend in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae untersucht, jedoch in Säugetieren größtenteils unbekannt. Um neue Erkenntnisse über die regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Proteinbiosynthese zu gewinnen, haben wir gentechnisch veränderte Knock-in Mäuse generiert, genannt MitoRibo-Tag Mäuse, welche ein mitoribosomales FLAG-tag-Fusionsprotein exprimieren. Mittels Massenspektrometrie haben wir das Mitoribosomeninteraktom in verschiedenen Geweben von MitoRibo-Tag Mäusen bestimmt. Der erstellte Proteinkatalog enthüllt bisher unbekannte Mitoribosomen-interagierende Proteine (MIPs) und gewebespezifische Proteinzusammensetzungen. Des Weiteren haben wir mittels Massenspektrometrie die Zusammensetzung eines Biogeneseintermediates von Mitoribosomen analysiert, welches in der Abwesenheit des Assemblierungsfaktors MTERF4 in Herzzellen von Mäusen akkumuliert. Die Untersuchung führte zur Identifikation des noch unerforschten Proteins PUSL1 als ein neues MIP. Die biochemische Lokalisierung von PUSL1 zeigt, dass PUSL1 ein mitochondriales Matrixprotein ist und mit der inneren Membran, sowie einem Biogeneseintermediat von Mitoribosomen, assoziiert. Ferner führt die RNA-Interfenz von PUSL1 zu einer spezifischen Reduktion der mitochondrialen de novo-Proteinbiosynthese. Zusammengefasst etabliert die vorliegende Dissertation MitoRibo-Tag Mäuse als ein neues Tool, um Mitoribosomen in vivo zu studieren, und ermöglicht zukünftige experimentelle Studien der mitochondrialen Translation unter verschiedenen physiologischen Bedingungen wie dem Altern, Diäten oder Krankheiten. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Busch, Jakob D. UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-353682
Date:	2019
Place of Publication:	Köln
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Biology of Ageing
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language mitochondria; mitochondrial biogenesis; mitochondrial DNA; mitochondrial gene expression; ribosome; translation; mitochondrial ribosome; in vivo mouse model; MitoRibo-Tag mice; OXPHOS English
Date of oral exam:	26 March 2019
Referee:	Name Academic Title Larsson, Nils-Göran Prof. Dr. Rugarli, Elena Prof. Dr.
References:	This dissertation/thesis also includes results from Busch et al. (2019) published in Cell Reports (Volume 29, ISSUE 6, P1728-1738.e9, November 05, 2019; https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.09.080 ). Moreover, experiments for collaborative projects related to published research papers are referenced in the respective chapters and the publication and reference lists (chapter 5 and 8). The experiments and data were prepared in partial fulfillment of my PhD thesis (at the Max Planck Institute for Biology of Ageing, Cologne, Germany and the University of Cologne).
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/35368