From the laboratory into the field: Testing defense mechanisms of bacterial biofilms against protozoan grazing

Erken, Martina (2011). From the laboratory into the field: Testing defense mechanisms of bacterial biofilms against protozoan grazing. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Protozoan grazing on bacteria is among the oldest predator-prey interactions in nature. While bacteria developed different defence strategies such as toxicity and microcolony formation to prevent grazing losses, protozoa developed different feeding mechanisms to compass these strategies. One important mode of grazing protection is biofilm formation. Its characteristics such as high bacterial densities and thus possible toxin production, as well as excretion of an extracellular matrix provide bacteria in biofilms with advantages in grazing protection compared to suspended bacteria. However, despite its importance, studies of protozoan grazing on biofilms are rare. This is partly due to the lack of appropriate methods to test mechanisms under complex field conditions. Here, different laboratory as well as field experiments were developed to investigate defence mechanisms of bacterial biofilms against protozoan grazers. The first part of this thesis demonstrates the impact of the ciliate Tetrahymena pyriformis on biofilms of the microcolony forming bacterial strain Acinetobacter sp. C6 and toxigenic and non-toxigenic strains of Vibrio cholerae, respectively. The grazer had a strong impact on the morphology of Acinetobacter sp. biofilms grown under various nutrient conditions. Microcolony formation did not protect the biofilms as such. However, biofilm biovolume of the grazed treatments stayed the same or increased during the course of the experiment indicating possible nutrient recycling. In a comparative study with T. pyriformis grazing on a toxigenic wild-type Vibrio cholerae strain A1552 and a genetically modified, non-toxigenic V. cholerae strain hapR it could be demonstrated that biofilms of the toxic V. cholerae A1552 supported less ciliates than biofilms of the non-toxic V. cholerae hapR. Microcolony abundances and active bacterial cells within the biofilms of V. cholerae A1552 increased compared to non-grazed control biofilms arguing for a mutual benefit for grazer and bacteria possibly due to nutrient recycling and chemical cues. In the second part of this thesis two new tools for environmental biofilm experiments are presented. (i) Diffusion chambers were successfully modified to expose toxigenic and non-toxigenic V. cholerae strains into the natural environment. The toxicity of wild-type V. cholerae A1552 for the flagellate Rhynchomonas nasuta could be verified. However, in comparison with the natural hapR mutant strain V. cholerae N16961, the level of toxicity impact on the flagellate varied dependent on seasonal background. The importance of nutrient concentration on V. cholerae toxicity could be demonstrated in subsequent laboratory experiments. This suggested a separate toxicity pathway beside the beforehand known hapR pathway. (ii) Two established methods of biofilm and protozoa observation were combined to quantify grazing interactions. The coupling of natural biofilm establishment in flow cells and video microscopic analysis of individual flagellate feeding revealed inter- as well as intra-specific differences and similarities in feeding behaviour and food preferences in three flagellate species. Whereas the three species showed distinct feeding behaviour, individuals of all species were only able to ingest single prey cells. Although microcolonies were contacted no cells were ingested. Thus, microcolony formation did protect bacteria against flagellate grazing. Taken together these experiments demonstrate the complex interactions of protozoa and bacteria on biofilms. Nutrient recycling, chemical and structural defence strategies of the bacterial community and the physical presence of the grazer have a major impact on biofilms. The presented methods such as the modified diffusion chambers and video microscopy in combination with the flow cell system are powerful tools to unravel the dynamics of predator-prey interactions on biofilms.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

Language

Der Fraß von Bakterien durch Protozoen gehört zu den ältesten Räuber-Beute Interaktionen in der Natur. Während Bakterien unterschiedliche Strategien als Schutz gegen Fraß von Protozoen entwickelten, (wie zum Beispiel die Produktion von Toxinen oder die Ausbildung von Mikrokolonien), entwickelten Protozoen unterschiedliche Fraßstrategien um Bakterien trotz Verteidigung konsumieren zu können. Obwohl die Interaktionen zwischen Protozoen und Bakterien im Plankton sehr gut untersucht sind, wurden die Dynamiken in Biofilmen bisher vernachlässigt. Die Ausbildung von bakteriellen Biofilmen, das heißt die Anheftung der Bakterien an ein Substrat, ist ein wichtiger Mechanismus zum Schutz vor Protozoenfraß. Biofilme sind charakterisiert durch eine hohe Dichte an Bakterien und die Produktion von extrazellulärer Matrix. Durch die hohe Dichte an Organismen und die Vielfalt an Verteidigungs- und Fraßstrategien sind die Interaktionen zwischen Bakterien und Protozoen ungleich komplexer als im Plankton. Trotzdem gibt es nur wenige Studien die sich mit diesem Thema beschäftigen. Ein grundlegendes Problem ist ein Mangel an Methoden, welche die Schutzmechanismen unter natürlichen Bedingungen testen könnten. Diese Arbeit stellt sowohl Labor- als auch Feldexperimente vor, die entwickelt wurden, um Verteidigungsmechanismen bakterieller Biofilme gegen den Fraßdruck von Protozoen zu testen. Der erste Teil der Arbeit zeigte, dass der Ciliat Tetrahymena pyriformis einen starken Einfluss auf die Morphologie der Biofilme von Acinetobacter sp. hatte. Das Biovolumen der Biofilme blieb während der Experimente kontant, beziehungsweise nahm zu, was auf ein mögliches Nährstoffrecycling durch die Ciliaten hindeutet. Dieses Nährstoffrecycling zeichnet sich dadurch aus, dass Nährstoffe durch Fraß planktischer Bakterien der bakteriellen Biofilmgemeinschaft zugeführt werden. Bei einer Herabsetzung der Nährstoffzufuhr, respektive der Nährstoffqualität, veränderte die Anwesenheit von T. pyriformis die Morphologie noch deutlicher. In einer vergleichbaren Studie wurde der gegenseitige Einfluss von T. pyriformis und den toxischen Vibrio cholerae A1552 (Wildtyp), beziehungsweise den genetisch modifizierten, nicht-toxischen V. cholerae hapR (Mutation im Toxin regulierenden hapR Gen) untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Abundanzen des Ciliaten auf Biofilmen des toxischen V. cholerae A1552 signifikant geringer waren als auf den Biofilmen des nicht-toxischen V. cholerae hapR. Die Anzahl der Mikrokolonien und der aktiven Bakterienzellen im V. cholerae A1552-Biofilm stieg im Vergleich zu Biofilmen, welche sich in Anwesenheit des Ciliaten entwickelten, an. Die Bedeutung von indirekten Effekten der Protozoen auf Bakteriengemeinschaften, beispielsweise durch Nährstoffrecycling, wird hierdurch erneut hervorgehoben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zwei neue Methoden zur Untersuchung von naturnahen Biofilmen etabliert. (i) Diffusionskammern wurden erfolgreich modifiziert um toxische und nicht toxische V. cholerae-Stämme in ihrer natürlichen Umgebung zu exponieren. Die Toxizität des Wildtyps V. cholerae A1552 gegenüber dem Flagellaten Rhynchomonas nasuta konnte für das Freiland bestätigt werden. Im Vergleich mit der natürlichen hapR Mutante V. cholerae N16961 jedoch variierte das Level der Toxizität je nach Jahreszeit. Darauf aufbauend konnte anschließend im Labor die Rolle der Nährstoffkonzentration auf die Toxizität von V. cholerae nachgewiesen werden, was auf einen hapR unabhängigen Pfad der Toxin-Regulierungsmechanismen hindeutet. (ii) Zur Quantifizierung des Fraßverhaltens von Protozoen auf Biofilmen wurden zwei etablierte Methoden, die Fließzelltechnik und die Videomikroskopie, kombiniert. Dabei konnten deutliche Unterschiede im Fraßverhalten von drei oberflächen-assoziierten Flagellatenarten nachgewiesen werden. Obwohl Mikrokolonien kontaktiert wurden, wurden ausschließlich Einzelzellen ingestiert. Dies verdeutlicht die Bedeutung von Mikrokolonien als Fraßschutz gegenüber Flagellaten. Alle Experimente belegen die komplexen Interaktionen von Protozoen und Bakterien in Biofilmen. Zusammenfassend betrachtend können Protozoen durch Nährstoffrecycling, sowie auch die chemischen und morphologischen Verteidigungsmechanismen der bakteriellen Gemeinschaft einen wesentlichen Einfluss auf die Biofilmgemeinschaften haben. Die hier neu oder weiterentwickelten Methoden, Diffusionskammern sowie Videomikroskopie in Verbindung mit dem Fließzellen-System, können in Zukunft wichtige Werkzeuge bei der Entschlüsselung von Räuber-Beute Dynamiken auf Biofilmen sein.

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