Universität zu Köln

Hoffmann, Daniel Christopher (2011). Functional characterization of the PlGF-2 heparin-binding domain. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Placenta growth factor (PlGF), a member of the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein family, is a critical regulator of vascular growth during processes of tissue remodelling including tissue repair and carcinogenesis. As reported for VEGF-A, the PlGF gene gives raise to different protein isoforms by mRNA splicing, which differ primarily in the presence or absence of a carboxyl-terminal domain, rich in basic amino acids (so called heparin-binding domain). The most abundantly expressed isoforms are PlGF-1 (lacking the heparin-binding domain) and PlGF-2 (expressing the heparinbinding domain). Whereas in recent years the heparin-binding domain of VEGF-A165, the major VEGF-A isoform that shares 46% amino acid sequence identity with PlGF-2, has emerged as essential domain for VEGF-A function, up to date little is known about the functional relevance of this domain present in PlGF-2. The aim of this project was to investigate the functional impact of the heparin-binding domain for PlGF-mediated activities. rhPlGF-1 and rhPlGF-2 were synthesized in HEK293 cells and used to perform differential structural and functional in vitro and in vivo bioassays. Analysis of protease sensitivity revealed that rhPlGF-2 is a target of the serine protease plasmin. Westernblot analysis and MALDI-TOF-mass-spectrometry of plasmin-digested rhPlGF-2 fragments identified a specific plasmin cleavage site (Lys118-Met119) resulting in loss of the C-terminal domain comprising the heparin-binding domain encoded by exon 6 and a short stretch of eight amino acids encoded by exon 7. The biological relevance of proteolytic cleavage of rhPlGF was corroborated by identifying a rhPlGF-2 cleavage fragment in non-healing, poorly vascularized human skin wounds, that was consistent with plasmin mediated cleavage. To characterize the functional consequences of plasmin-mediated cleavage of rhPlGF-2, a truncated form of rhPlGF (PlGFStop) was generated, representing the plasmin-resistant N-terminal fragment (Leu1-Lys118). Chemotaxis and endothelial cell sprouting analysis revealed striking differences among the PlGF isoforms. Whereas rhPlGF-2 induced a robust chemotactic and endothelial cell sprouting response on HUVE and porcine endothelial cells stably transfected with Neuropilin-1 (PAE/Nrp-1), the activity of rhPlGF-1, plasmin processed rhPlGF-2 and the rhPlGFStop mutant was significantly attenuated. Furthermore, the induction of a vascularized granulation tissue in wounds of impaired healing diabetic mice could be significantly stimulated by topical application of rhPlGF-2, whereas application of rhPlGF-1 or rhPlGFStop showed weak effects. These findings indicate that the heparinbinding domain of PlGF-2 stimulates endothelial cell functions in vitro and promotes angiogenesis in vivo. To unravel the underlying molecular mechanisms for the increased biological potency of PlGF-2, binding to diverse extracellular matrix components and the VEGFR-1 co-receptor Nrp-1 as well as signalling pathways were investigated. Surface Plasmon Resonance spectroscopy demonstrated a high affinity of rhPlGF-2, but unexpectedly also of rhPlGF-1 for several glycosaminoglycanes (heparin, heparan sulphate and chondroitin sulphate). These findings indicate that the binding capacity of PlGF to the selected glycosaminoglycanes is dependent on the amino acids encoded by exon 7, which is present in both isoforms. The heparin-binding domain present exclusively in PlGF-2 appears not to be essential for binding of the investigated GAGs. rhPlGF-2 revealed a moderate binding to Nrp-1, which was significantly increased in the presence of heparin. The absence of the entire C-terminal domain encoded by exon 6 and 7 (represented by the rhPlGFStop mutant) resulted in complete loss of any tested binding capacity. Activation of VEGFR-1 appears to be independent of the C-terminal domain, because all isoforms rhPlGF-2 and rhPlGFStop resulted in an activation of VEGFR-1 and its downstream targets Akt and Erk-1/-2. Analysis of signalling pathways in endothelial cells suggested that increased rhPlGF-2-induced cellular responses were in part mediated by increased activation of tyrosine kinases FAK (focal adhesion kinase) and Src family kinases. In addition, activation of both kinases was enhanced by Nrp-1 overexpression and exposure of endothelial cells to collagen I. Collectively, our findings propose novel functions of the heparin-binding domain of PlGF- 2 and of the C-terminal domain of PlGF-1 and indicate that plasmin-mediated proteolysis is a major switch to control PlGF-mediated angiogenesis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Funktionelle Charakterisierung der PlGF-2 Heparin-bindenden Domäne German
Translated abstract:	Abstract Language Der plazentale Wachstumsfaktor (PlGF), ein Mitglied der Familie der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF), ist bekannt als wichtiger Mediator für die Regulation des Gefäßwachstums während des Gewebeumbaus. Dies gilt in besonderem Maße für die Hautregeneration und Karzinogenese. Ähnlich wie für VEGFA gezeigt, wird die Expression von PlGF durch alternatives mRNA Splicing eines plgf- Gens reguliert, und führt zur Bildung von verschiedenen Proteinisoformen. Diese unterscheiden sich maßgeblich durch alternative Expression einer stark basischen Domäne am Carboxylende des Proteins (Heparin-bindende Domäne). Bei den am häufigsten exprimierten Isoformen handelt es sich um PlGF-1 (ohne Heparin-bindende Domäne) und PlGF-2 (mit Heparin-bindender Domäne). Die Funktion der Heparin-bindenden Domäne von VEGF-A165 war in den letzten Jahren Forschungsgegenstand zahlreicher Untersuchungen, durch deren Ergebnisse die essentielle Rolle der Heparin-bindenden Domäne für die Aktivität von VEGF-A165 gezeigt werden konnte. Die Funktion der Heparin-bindenden Domäne von PlGF-2 hingegen blieb trotz hoher Sequenzhomologie zu VEGF-A165 (46%) bis heute weitgehend ungeklärt. Um die strukturellen und funktionellen Unterschiede zwischen rhPlGF-1 und rhPlGF-2 näher zu untersuchen, wurden diese Isoformen in HEK293 Zellen exprimiert und in verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten charakterisiert. Untersuchungen der Proteasesensitivität von rhPlGF-2 ergaben, dass PlGF ein Zielprotein der Serinprotease Plasmin ist. Die daraus resultierende C-terminale Fragmentierung wurde mit Hilfe von Western Blot und MALDI-TOF-Massenspektroskopischer Analyse untersucht. Neben mehreren Schnittstellen innerhalb der Heparin-bindenden Domäne, konnte Lys118-Met119 als die am weitesten N-terminal gelegene spezifische Plasminschnittstelle identifiziert werden. Um die funktionellen Konsequenzen dieser proteolytischen Prozessierung von rhPlGF-2 näher zu untersuchen, wurde eine verkürzte Form von rhPlGF (PlGFStop) generiert, welche den plasminresistenten, Nterminalen Bereich von PlGF umfasst (Leu1-Lys118). Vergleichende Untersuchungen von rhPlGF-1, rhPlGF-2 und rhPlGFStop bezüglich ihrer chemotaktischen Aktivität und ihrer Fähigkeit eine Gefäßaussprossung zu fördern, zeigten signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen PlGF Isoformen auf. Während rhPlGF-2 eine deutliche chemotaktische Antwort in HUVE Zellen und Neurpilin-1-transfizierten Endothelzellen aus der Aorta des Schweins hervorrief und die Ausbildung von gefäßähnlichen Strukturen induzierte, zeigten sowohl rhPlGF-1, Plasmin-prozessiertes rhPlGF-2 als auch die mutierte Form rhPlGFStop eine klar verminderte Aktivität. Weiterhin förderte die topische Applikation von rhPlGF-2 in Wunden von diabetischen Mäusen mit verzögerter Wundheilung eine signifikante Zunahme an vaskularisiertem Granulationsgewebe. Im Gegensatz dazu, wiesen rhPlGF- 1 und rhPlGFStop nur geringe Effekte auf. Zusammenfassend konnten die Ergebnisse eine klare Funktionalität der Heparin-bindenden Domäne von rhPlGF-2 aufzeigen, zum einen durch die Stimulation endothelialer Zellfunktionen in vitro und zum anderen durch angiogenesefördernde Effekte in vivo. Um die zugrunde liegenden Mechanismen für die gesteigerte Bioaktivität von PlGF-2 zu identifizieren, wurde sowohl die Bindung der unterschiedlichen PlGF Isoformen an verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix und an den Korezeptor Nrp-1 gemessen, als auch mögliche Signaltransduktionswege untersucht. Mit Hilfe von Surface Plasmon Resonance Spektroskopie wurde gezeigt, dass sowohl rhPlGF-2 als auch – unerwarteter Weise rhPlGF-1 - eine starke Affinität für verschiedene untersuchte Glykosaminoglykane (GAGs) aufweisen (Heparin, Heparansulfat, Chondroitinsulfat). Diese Ergebnisse lassen vermuten, das die Interaktion zwischen PlGF und den untersuchten GAGs hauptsächlich durch die von Exon 7 codierten Aminosäuren vermittelt wird, welche in beiden Isoformen expremiert werden. Die Heparin-bindenden Domäne in PlGF-2 scheint nicht essentiell für eine Bindung an die untersuchten GAGs zu sein. Zusätzlich konnte eine moderate Bindung von rhPlGF-2 an Nrp-1 gemessen werden, die jedoch in Anwesenheit von Heparin signifikant um den Faktor 100 verstärkt wurde. Das Fehlen der C-terminalen Domäne (kodiert von Exon 6 und 7) in rhPlGFStop führte zu einem vollständigen Verlust der Bindungskapazität in allen durchgeführten Messungen. Diese C-terminale Verkürzung des Proteins scheint jedoch keinen maßgeblichen Einfluss auf die Bindung an den VEGFR-1 zu haben. Nach Stimulation mit rhPlGFStop oder rhPlGF-2 zeigten sowohl VEGFR-1, als auch die nachgeschalteten Signalproteine Akt und Erk-1/-2 eine vergleichbare Phosphorylierung. Eine weiterführende Analyse möglicher Signaltransduktionswege in Endothelzellen lässt darauf schließen, dass die durch rhPlGF-2 induzierte verstärkte endotheliale Zellaktivität teilweise durch eine Aktivierung der Tyrosinkinasen FAK (focal adhesion kinase) und Src vermittelt sein könnte. Zusätzlich konnte eine verstärkte Phosphorylierung dieser Kinasen bei Nrp-1 Überexpression und Collagen I Exposition beobachtet werden. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit neue Funktionen der Heparin-bindenden Domäne von PlGF-2 und der C-terminalen Domäne von PlGF-1 aufgezeigt werden. Die Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die durch Plasmin vermittelte, C-terminale Proteolyse eine Schüsselkomponente für die durch PlGF induzierte Angiogenese darstellt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hoffmann, Daniel Christopher daniel.c.hoffmann@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-41577
Date:	14 February 2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut II für Biochemie
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Placenta Growth Factor UNSPECIFIED Angiogenesis UNSPECIFIED
Date of oral exam:	8 April 2011
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr. Hammerschmidt, Matthias Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4157