Charakterisierung der AP2 dephosphorylierenden Phosphatase PP2A und Identifikation von B55 alpha Bindungspartnern

Teichert, Dominic (2010). Charakterisierung der AP2 dephosphorylierenden Phosphatase PP2A und Identifikation von B55 alpha Bindungspartnern. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Der Adaptorprotein-Komplex 2 (AP2) ist ein Schlüsselfaktor bei der Bildung von Clathrin-coated vesicles (CCVs), die im Rahmen der Endozytose an der Plasmamembran gebildet werden. Die Phosphorylierung von Thr156 in der mu2- Untereinheit spielt eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung von AP2 an der Membran. Die Phosphorylierung erfolgt durch AAK1, als antagonistisches Enzym wurde ein trimeres Proteinphosphatase 2A (PP2A) Holoenzym durch unsere Arbeitsgruppe identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit soll die Relevanz der Phosphatase in Zellen überprüft und die Rekrutierung des Enzyms an CCVs untersucht werden. Im ersten Teil wurde in HeLa-Zellen gezeigt, dass die Suppression der regulatorischen B55 alpha Untereinheit der PP2A zu einer verstärkten Phosphorylierung von mu2 führt. Allerdings war weder der Nachweis einer Ko-Lokalisation mittels Immunfluoreszenz, noch eine Ko-Präzipitation von AP2 und PP2A Untereinheiten möglich. Demgegenüber gelang uns der Nachweis der PP2A-Untereinheiten in CCVs in einer Stöchiometrie von ungefähr 1,6:1:1 (A:B55:C) mit berechneten Stoffmengen von 400-660 fmol pro mg CCVs. Daraus lässt sich ableiten, dass PP2A ca. 1/10.000 ug eines CCVs ausmacht. Die massenspektroskopische Analyse von CCVs ermöglichte die Identifikation von 216 Proteinen, von denen einige bisher nicht als CCV-Bestandteil bekannt waren. Neben mind. 50 Transmembran-, 3 Lipidbindenden-, 9 SNARE- und 13 Zytoskelett- Proteinen beinhaltet die Liste auch die A-Untereinheit von PP2A. Durch Verwendung eines phospho-Tyrosin-spezifischen Antikörpers gelang es zu zeigen, dass das Tyr307 der C-Untereinheit von PP2A in CCVs im Vergleich zu HeLa-Zellen um den Faktor 4 verstärkt phosphoryliert ist. Da bereits bekannt ist, dass diese Phosphorylierung zur PP2A-Inaktivierung führt, kann daraus gefolgert werden kann, dass die Phosphatase in CCVs vorwiegend inaktiv vorliegt. Außerdem erfolgte eine massenspektroskopische Identifizierung von Proteinen, die zusammen mit einer FLAG-markierten B55 alpha-Untereinheit immunisoliert werden konnten. In weiterführenden Arbeiten müssen die Interaktionen bestätigt und deren Zusammenhang analysiert werden.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

The adaptor complex AP2 plays a key role in clathrin-coated vesicle (CCV) formation during endocytosis at the plasma membrane. Three of the four subunits of AP2 are phosphorylated, but only the significance of mu2 phosphorylation at Thr156 is characterised. The modification, which is catalyzed by the kinase AAK1 is necessary for stabilization of the open conformation of the complex and efficient cargo recruitment. Dephosphorylation of E2 is catalyzed by a trimeric protein phosphatase 2A (PP2A) holoenzyme, which was identified by our group. The aim of this thesis was to show the relevance of the phosphatase in cells and to unravel the recruitment of the enzyme to CCVs. We took an RNAi approach to suppress the regulatory PP2A B55 alpha subunit in HeLa cells. In the affected cells we could detect an increased level of phosphorylation of mu2. This indicates that indeed a specific PP2A form is involved in the control of the phosphorylation at Thr156 in the mu2-subunit of AP2. Unfortunately we failed to show a co-staining of both the enzyme and AP2. Furthermore co-precipitations of AP2 with PP2A and vice versa were not obtained. When using CCVs purified from pig brain we could detect all three PP2A subunits by westernblotting and based on the quantification we propose a stoichiometry of 1,6:1:1 (A:B55 :C) with absolute amounts of ~400-660 fmol per mg CCVs. Thus, one out of 10.000 Eg represents PP2A. In the course of these experiments we used the CCVs to determine the proteome. A total of 437 were identified out of which 216 represent highly-relevant CCV proteins. These include 55 trans-membrane-proteins, 8 cargo adaptor proteins and at least 3 other lipid binding proteins and noteworthy the A-subunit of PP2A. Unfortunately, the low abundance of PP2A in CCVs did not allow direct identification of posttranslational modifications that may important for enzyme regulation. However, by using a phospho-tyrosine specific antibody in westernblots we revealed a high level of Y307 phosphorylation of the catalytic subunit of PP2A, which renders the enzyme inactive. In an alternative approach we used pull-down experiments with a recombinant FLAG-tagged B55 alpha subunit to identify binding partners and putative new PP2A substrates. A total of 368 proteins were identified, some of which will be further characterized in future experiments.

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