Universität zu Köln

Kleemann, Jochen (2010). Identification and functional characterization of secreted effector proteins of the hemibiotrophic fungus Colletotrichum higginsianum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The hemibiotrophic ascomycete fungus Colletotrichum higginsianum causes anthracnose on cruciferous crops and the model plant Arabidopsis thaliana. Successful infection of wild-type plants requires sequential development of specialized infection structures, including melanized appressoria for initial penetration, and bulbous biotrophic hyphae formed inside living epidermal cells. It was hypothesized that appressoria and biotrophic hyphae secrete effector proteins that permit the fungus to evade or disarm host defence responses and to reprogram host cells. This study aimed to define the repertoire of fungal effectors expressed during plant infection and to characterise their biological activity. Discovery of Colletotrichum higginsianum Effector Candidates (ChECs) was accomplished by computational mining collections of infection stage-specific expressed sequence tags (ESTs) for genes encoding solubly secreted proteins with either no homology to known proteins or resembling presumed effectors from other pathogens. Fungal cell types and infection stages sampled for cDNA generation and pyrosequencing included developing and mature in vitro appressoria, early invasive growth in planta, biotrophy and late necrotrophy. After assembling contiguous sequences, analysis of their EST composition allowed the identification of putative plant-induced genes and the definition of a set of 69 ChEC genes that are preferentially expressed at biotrophy-relevant stages. In relation to other infection stages, the early host invasion transcriptome was enriched for genes encoding higginsianum-specific proteins and plant-induced secreted proteins, including ChECs. This suggests that the initial establishment of biotrophy requires the highest proportion of stage-specific effectors and diversified genes. One further ChEC was identified using a complementary proteomic analysis of secreted proteins produced by conidial germlings developing in vitro. Expression analysis showed that transcription of most of the ChECs chosen for further study were highly stage-specific, with ChEC3, ChEC3a, ChEC4 and ChEC6 all being plant-induced. Targeted gene replacement showed that neither ChEC1 nor ChEC2 contribute measurably to fungal virulence. Upon transient expression in tobacco, ChEC3, ChEC3a or ChEC5 all suppressed plant cell death evoked by a C. higginsianum homologue of Necrosis and Ethylene-inducing Peptide1-like proteins, but not by the Phytophthora infestans elicitin INF1, suggesting that there is functional redundancy between C. higginsianum effectors. ChEC4 was found to contain a functional nuclear localization signal and signal peptide, and was shown to be secreted by the fungus during plant infection using fluorescent protein-tagging. This raises the possibility that ChEC4 is translocated into the host nucleus for transcriptional re-programming.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Der hemibiotrophe Ascomycet Colletotrichum higginsianum gilt als Erreger der Anthraknose bei Kulturpflanzen aus der Familie der Brassicaceae und kann die Modellpflanze Arabidopsis thaliana befallen. Eine erfolgreiche Infektion der Pflanze erfordert die sequenzielle Ausbildung von spezialisierten Infektionsstrukturen: Melanisierte Appressorien ermoeglichen die Penetration des Wirts und verdickte Primaerhyphen treten in eine biotrophe Interaktion mit der penetrierten, lebenden Zelle. Es wird vermutet, dass Appressorien und biotrophe Primaerhyphen Effektorproteine sekretieren, die es dem Pilz ermöglichen, die pflanzliche Wirtszelle umzuprogrammieren und ihre Immunabwehr auszuschalten oder zu unterwandern. Zielsetzung dieser Arbeit war die Bestimmung des Repertoirs an in planta exprimierten C. higginsianum Effektorprotein-Kandidaten (ChECs) und die Charakterisierung ihrer biologischen Aktivitaet. Identifizierung von ChECs erfolgte durch bioinformatisches Screening von infektionsstadiums-spezifischen expressed sequence tags (ESTs). Gesucht wurde dabei nach pilzlichen Genen die für loeslich sekretierte Proteine kodieren und die entweder keine Homologie zu bekannten Proteinen aufweisen oder Aehnlichkeit mit vermuteten Effektorproteinen anderer Pathogene haben. cDNA Praeparation und Pyrosequenzierung erfolgte von folgenden Zelltypen und Infektionsstadien: Sich entwickelnde und ausgereifte in vitro Appressorien, fruehe Wirtspenetration sowie biotrophes und spaetes nekrotrophes Stadium. Die Analyse der EST Zusammensetzung der contigs nach Assemblierung erlaubte die Identifizierung pflanzeninduzierter Gene und von 69 ChEC Genen mit vorwiegender Expression in biotrophie relevanten Stadien. Im Vergleich zu anderen Infektionsstadien zeigte das wirtspenetrations-spezifische Transkriptom den hoechsten Anteil an higginsianum-spezifischen Genen sowie an Genen, die für sekretierte Proteine im Allgemeinen und ChECs im Besonderen kodieren. Dies laesst vermuten, dass für die Etablierung der biotrophen Interaktion der hoechste Anteil an infektionsstadiums-spezifischen Effektoren und diversifizierten Genen notwendig ist. Proteine die waehrend der in vitro Appressorien-Morphogenese sekretiert wurden, konnten mit Hilfe einer Proteomanalyse direkt identifiziert werden. Dieser ergaenzende Ansatz erlaubte außerdem die Identifizierung eines weiteren ChECs. Expressionsanalyse zeigte, dass die Expression der meisten der zur weiteren Untersuchung ausgewaehlten ChECs sehr infektionsstadiums-spezifisch war. ChEC3, ChEC3a, ChEC4 und ChEC6 konnten als pflanzeninduziert identifiziert werden. Knockout Mutanten, denen ChEC1 und ChEC2 fehlte, zeigten keine messbare Reduzierung der Virulenz. Mit Hilfe transienter Expression in Tabak konnte gezeigt werden, dass der durch ein C. higginsianum Homolog eines Necrosis and Ethylene-inducing Peptide1-like protein hervorgerufene Zelltod durch Co-Expression von ChEC3, ChEC3a oder ChEC5 supprimiert werden kann, was funktionale Redundanz zwischen C. higginsianum Effektoren vermuten laesst. Dahingegen war der Zelltod, der durch das Elizitin INF1 von Phytophthora infestans hervorgerufen wurde, nicht supprimierbar. Fuer ChEC4 konnte sowohl eine funktionale Kern-Lokalisationssequenz als auch ein funktionales Signalpeptid experimentell bestaetigt werden. Durch Fusion mit einem fluoreszierenden Protein konnte die Sekretion von ChEC4 waehrend der Infektion der Pflanze gezeigt werden. Dies zeigt, dass ChEC4 das Potenzial hat, in den Zellkern der Wirtszelle transloziert zu werden, um dort moeglicherweise die Transkription zu beeinflussen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kleemann, Jochen Kleemann@mpipz.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-42027
Date:	8 September 2010
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Colletotrichum higginsianum UNSPECIFIED expressed sequence tags English effector proteins English hemibiotrophy English pyrosequencing English proteomics English appressoria English biotrophic hyphae English in planta transcriptome English cell death suppression English Arabidopsis thaliana UNSPECIFIED Effektorproteine German Hemibiotrophie German Pyrosequenzierung German Proteom German Appressorium German Biotrophe Hyphen German in planta Transkriptom German Zelltod German
Date of oral exam:	20 October 2010
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr. Huelskamp, Martin Prof. Dr. Martijn, Rep Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4202