Identifizierung zellulärer Zielgene des humanen Papillomvirus Typ 8 (HPV8) in transgenen Mäusen und humanen Keratinozyten

Lazić, Daliborka (2011). Identifizierung zellulärer Zielgene des humanen Papillomvirus Typ 8 (HPV8) in transgenen Mäusen und humanen Keratinozyten. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Während die ätiologische Rolle genitaler humaner Papillomviren (HPV) bei der Entstehung des Zervixkarzinoms anerkannt ist, wird die Bedeutung der Infektion mit beta HPV Typen wie HPV8 bei der Entstehung von nicht-melanozytären Hautkrebs noch kontrovers diskutiert. Mit der Etablierung HPV8 transgener Mäuse, die die gesamte frühe Region (GFR = E1/E2/E4/E6/E7) oder nur –E6 bzw. –E2 unter der Kontrolle des humanen Keratin14 Promotors exprimieren, konnte das onkogene Potential von HPV8 in vivo gezeigt werden. Transgene Mäuse entwickelten spontan Hauttumoren und durch einmalige UVA/B-Bestrahlung, welche die Transgenexpression induziert, konnte die Tumorentwicklung innerhalb von drei Wochen synchronisiert werden. Um den Einfluss der HPV8 Onkogene auf die zelluläre Genexpression zu untersuchen, wurden cDNA Micro Array Analysen durchgeführt, die beim Vergleich von nicht-läsionaler HPV8-GFR mit FVB/n wt Maushaut auf eine Deregulation von 17 zellulären Genen hindeutete, von denen 14 in der quantitativen RT-PCR gemessen werden konnten. Dabei wurden StefinA, Sprr2 und Dusp1 als direkte/indirekte HPV8 Zielgene identifiziert. Um die StefinA Expression während der UV-induzierten Papillomatose zu untersuchen, wurden 5 Wochen alte Tiere einmalig bestrahlt. UV-Bestrahlung führte in beiden Mauslinien zu einem starken Anstieg der mRNA Spiegel, wobei in HPV8-GFR transgenen Mäusen bis zum Tag 10 etwas mehr StefinA mRNA gemessen werden konnte als in FVB/n wt Tieren. Im Zuge der Wundheilung beginnend zwischen 7 und 10 Tage nach UV-Bestrahlung sank in den FVB/n wt Tieren die StefinA Expression ab, während die anhaltende Hyperproliferation in HPV8-GFR Tieren mit signifikant erhöhten StefinA mRNA Spiegeln korrelierte. Durch Färbung eines UV-induzierten FVB/n wt Papilloms konnte jedoch gezeigt werden, dass die Überexpression von StefinA in Hauttumoren mit Hyperproliferation assoziiert und unabhängig von der Gegenwart der HPV8 Onkogene ist. Da StefinA aber in HPV8-GFR und –E6 transgenen Mäusen, die im Bezug auf die Papillomentwicklung eine Phänokopie der GFR Tiere darstellen, bereits in nicht-läsionaler Maushaut hochreguliert ist, könnte es auch eine Rolle früh in der HPV8 induzierten Tumorentwicklung spielen. Während in der HPV8-GFR Maus für Syntenin-2, welches laut cDNA Micro Array Vorhersage dereguliert sein sollte, eine Modulation durch das Virus nicht deutlich wurde, konnte in primären humanen Keratinozyten eine Repression der Syntenin-2 Transkription durch HPV8-E6 gezeigt werden. Die Syntenin-2 Proteinspiegel waren in differenzierteren Keratinozyten HPV8-E6 exrimierender Monolayer-Kulturen sowie organotypischer Kulturen experimentell immortalisierter, HPV8-E6 exprimierender nTERT Keratinozyten deutlich erniedrigt. Im Gegensatz zu differenzierten Schichten normaler humaner Epidermis konnte in invasiven Bereichen von Plattenepithelkarzinomen keine Syntenin-2 Expression nachgewiesen werden. Auch in spontan immortalisierten humanen Keratinozyten-Zelllinien waren die Syntenin-2 mRNA Spiegel signifikant erniedrigt und konnten durch HPV8-E6 nicht weiter gesenkt werden. Die biologische Signifikanz der HPV8-E6 vermittelten Syntenin-2 Repression wurde durch spezifischen knock-down in primären Keratinozyten überprüft. Nach Syntenin-2 knock-down kam es zur verlängerten Lebensspanne der primären Keratinozyten sowie wie bei Expression von HPV8-E6 zur Störung der Expression des Differenzierungsmarkers Involucrin in Monolayer-Kultur und der epithelialen Schichtung in der organotypischen Kultur. Dies lässt die Vermutung zu, dass HPV8-E6 die Störung der Differenzierung hauptsächlich über die direkte/indirekte Repression von Syntenin-2 erreicht.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

While an aetiological role of alpha human papillomviruses (HPV) during the development of cervix carcinoma is generally accepted, the impact of beta HPV Types, like HPV8, during the development of non-melanoma skin cancer is still a matter of debate. By establishing HPV8 transgenic mouse lines that express the complete early region (CER = E1/E2/E4/E6/E7) or only –E6 or –E2 under the control of the human keratin 14 promoter, the oncogenic potential of HPV8 could be demonstrated in vivo. Transgenic mice spontaneously developed skin tumors, and one UVA/B-irradiation, which induced transgene expression, was sufficient to synchronized papilloma development within three weeks. To evaluate the influence of HPV8 oncogenes on cellular gene expression, cDNA micro array analyses were performed. Comparison of non-lesional HPV8-CER and FVB/n wt skin predicted deregulation of 17 cellular genes, of which 14 could be measured in quantitative RT-PCR analyses. In doing so, StefinA, Sprr2 and Dusp1 could be identified as direct/indirect target genes of HPV8. To investigate the StefinA expression during UV-induced papilloma development, mice at an age of 5 weeks were treated once with UVA/B. UV-irradiation lead to increased StefinA mRNA levels and slightly higher StefinA mRNA levels could be measured in HPV8-CER transgenic mice until day 10 post treatment when compared with FVB/n wt animals. During wound healing, which started around day 7 to 10 post treatment, StefinA mRNA expression decreased in FVB/n wt mice while its increased levels persisted in hyperproliferative HPV8-CER transgenic skin. By staining an UV-induced FVB/n wt skin tumor it could be demonstrated that the increased StefinA protein expression in skin tumors is independent of the presence of HPV8 and associated with hyperproliferation. However, the observation that StefinA is already upregulated in non-lesional skin of both HPV8-CER and –E6 transgenic mice, which are phenocopies of HPV8-CER mice in terms of papilloma development, points to a possible role of StefinA early during HPV8 induced skin tumor development. The expression of the PDZ protein Syntenin-2, which was predicted by cDNA micro array analyses to be deregulated in transgenic skin, could not be confirmed in transgenic mice skin by quantitative RT-PCR. However, in primary human keratinocytes, Syntenin-2 was identified to be transcriptionally inhibited by HPV8-E6. The Syntenin-2 protein expression was notedly reduced in both differentiated HPV8-E6 expressing keratinocytes in monolayer culture as well as in experimental immortalized, HPV8-E6 expressing nTERT keratinocytes in organotypic cultures. In contrast to differentiated normal human epidermis, Syntenin-2 protein expression could not be observed in invasive areas of squamous skin carcinomas. Spontaneously immortalized cutaneous cell lines exhibited significantly reduced Syntenin-2 mRNA levels, which could not be influenced by HPV8-E6 expression. The biological significance of Syntenin-2 downregulation in primary human keratinocytes was studied by specific knock-down within primary human keratinocytes. Syntenin-2 knock-down lead to an expanded life span of these primary keratinocytes and, as observed in HPV8-E6 expressing cells, to disrupted expression of the differentiation marker Involucrin in monolayer culture and epithelial arrangement in organotypic culture. Therefore it is tempting to speculate that HPV8-E6 might trigger disruption of differentiation mainly by direct/indirect repression of Syntenin-2.

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