Universität zu Köln

Kwiecinski, Monika (2011). Die Rolle der microRNA-29 während der Leberfibrogenese. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

MicroRNAs (miRNAs) are short, noncoding RNA molecules that posttranscriptionally regulate gene expression by targeting the 3´-untranslated region (3´-UTR) of mRNAs. Interaction of miRNA with the 3´-UTR results either in RNA degradation or in translational repression that affects various fundamental biological processes and different diseases. The aim of the present study was the identification of one miRNA which is involved in basic mechanisms of fibrogenesis. Activation of hepatic stellate cells (HSC) by profibrogenic growth factor stimulation leads to their transdifferentiation into activated myofibroblastic HSC. During liver fibrogenesis these activated HSC are the main cell type of matrix accumulation and profibrogenic growth factor secretion. In this doctoral thesis work, algorithms of different databases identified miR-29 as a putative repressor of the collagen transcripts Col1A1, Col1A2, Col4A1, Col4A5 as well as the profibrotic cytokines “Vascular Endothelial Growth Factor-A” (VEGF-A), “Platelet-Derived Growth Factor-C” (PDGF-C), and Insulin-Like Growth Factor-I” (IGF-I) mRNAs. In order to demonstrate miRNA binding and translational inhibition, reporter assays were performed. Reporter luciferase plasmids containing either the putative miR-29 binding sites from the 3´-UTR sequences of the target transcripts or corresponding binding sites with two point mutations were constructed. Thus, the interaction of miR-29 with the target sequence leads to repression of the luciferase activity. Indeed, reporter assays revealed that cotransfection of miR-29 causes repression of the reporter acitvity. Additionally, miR-29 treatment of HSC resulted in repression of Col1A1, Col1A2, Col4A1, Col4A5 transcripts, and profibrotic cytokines PDGF-C and IGF-I synthesis. Furthermore, miR-29 levels were reduced in an experimental rat model with liver fibrosis after bile duct occlusion. Additionally, during myofibroblastic differentiation of primary HSC isolated from rat livers and cultured on a plastic surface to induce myofibroblastic transition, decreasing miR-29 expression level was observed. Therefore the abolished inhibition of collagen, PDGF-C and IGF-I synthesis during liver fibrogenesis can be explained by the reduced miR-29 expression in myofibroblastic HSC. Stimulation of HSC with the fibrogenic mediators, “Transforming Growth Factor-β“ (TGF-β) and “Platelet-Derived Growth Factor BB” (PDGF-BB), augmented whereas the antifibrogenic “Hepatocyte Growth Factor” (HGF) decreased the collagen type I and IV synthesis. In contrast, the influence of TGF-β and PDGF-BB induced a repression whereas HGF led to an induction of miR-29 expression. Therefore, regulation of miR-29 expression is the focus of the antagonism between TGF-β and HGF. Interestingly, the decrease of miR-29 in HSC, mediated by TGF-β and PDGF-BB, was accompanied by highly elevated levels of miR-29 in the supernatant. A secretion of vesicles from HSC after TGF-β and PDGF-BB stimulation was evidenced by negative staining. These vesicles contained high amounts of miR-29. Hence, regulation of miR-29 in HSC is suggested with an increase of extracellular miR-29a by vesicular release from HSC in vitro. Finally, for a myofibroblast-specific expression of the antifibrogenic miR-29, an adenoviral vector was created and successfully tested in activated HSC. Thus, the presented study provides a novel perspective to analyze the antifibrogenic function of miR-29 in an experimental liver fibrosis model in vivo.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht kodierende RNA Moleküle, die posttranskriptionell durch komplementäre Bindung an den 3´-untranslatierten Bereich (3‘-UTR) die Translation ihrer Zieltranskripte unterdrücken. Eine Deregulation von miRNAs wird mit veränderten Syntheseabläufen und diversen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Auf Grund dessen wurde in der vorliegenden Arbeit eine miRNA ermittelt, welche in die grundlegenden Abläufe chronischer Lebererkrankungen involviert ist. Hepatische Sternzellen (HSC), die durch parakrine Stimulierung mit profibrogenen Zytokinen aktiviert werden und zu Myofibroblasten-ähnlichen Zellen differenzieren, stellen den zentralen Zelltyp der Leberfibrogenese dar. Die aktiven HSC zeichnen sich nicht nur durch eine vermehrte Synthese und Deposition von extrazellulären Matrixproteinen aus, sondern auch durch die Expression profibrogener Mediatoren. In der vorliegenden Arbeit wurde über in silico Analysen die miR-29 als möglicher Syntheserepressor der Kollagentranskripte Col1A1, Col1A2, Col4A1, Col4A5 sowie der profibrogenen Zytokine „Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) -C“, insulinähnlicher Wachstumsfaktor I (IGF-I) und „Vascular Endothelial Growth Factor-A“ (VEGF-A) identifiziert. Anschließende Bindungsstudien mit Plasmidkonstukten, welche die potentielle Bindungssequenz der 3´-UTR der identifizierten Zieltranskripte in einem Reportergen beinhalteten, belegten die miR-29 Interaktion durch erniedrigte Reporteraktivitäten. Durch die Behandlung von HSC mit miR-29 konnte anschließend die Repression sowohl der Kollagentypen I und IV als auch der profibrogenen Zytokine PDGF-C und IGF-I nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte in einem experimentellen Fibrosemodell, bei dem durch Gallengangsokklusion in Ratten eine Leberfibrose induziert wurde, gezeigt werden, dass eine signifikante Erniedrigung der antifibrogenen miR-29 vorlag. Die Analysen während der myofibroblastischen Differenzierung von primären HSC, die aus der Ratte isoliert wurden und in Kultur den myofibroblastischen Entwicklungsprozess durchliefen, zeigten ebenfalls einen abnehmenden miR-29 Spiegel. Daher kann die fehlende Inhibierung, sowohl der Kollagensynthese als auch der Produktion der Mediatoren PDGF-C und IGF-I während der Leberfibrogenese, durch die reduzierte miR-29 Expression in Myofibroblasten-ähnlichen HSC erklärt werden. Nach Stimulierung der HSC mit dem fibrogenen Wachtumsfaktor „Tissue Growth Factor-β“ (TGF-β) und PDGF-BB erfolgte eine verstärkte Synthese der Kollagentypen I und IV, während der „Hepatocyte Growth Factor“ (HGF) eine Repression bewirkte. Dagegen wurde unter dem Einfluss von TGF-β und PDGF-BB eine Repression, durch HGF jedoch eine Induktion der miR-29 beobachtet. Die Regulation der miR-29 Expression unterliegt demzufolge diesen pro- und antifibrogenen Mediatoren. Die TGF-β und PDGF-BB vermittelte Abnahme der miR-29 in HSC wurde von einer deutlichen Sekretion der miR-29 in den Kulturüberstand begleitet. Durch Färbungen konnte belegt werden, dass HSC nach Stimulierung mit TGF-β und PDGF-BB vermehrt Vesikel ausscheiden. Diese Vesikel enthielten erhöhte Mengen an miR-29. Die Regulation der miR-29a ist somit in vitro in HSC mit einem Anstieg extrazellulärer miR-29a durch ein vesikuläres Freisetzen aus den HSC verbunden. Abschließend wurde ein Myofibroblasten-spezifischer und miRNA-exprimierender Vektor hergestellt, der die gezielte Expression der antifibrogenen miR-29a in Myofibroblasten-ähnlichen HSC ermöglichte. Damit wurden die grundlegenden Voraussetzungen geschaffen, um die hier gezeigte antifibrogene Funktion der miR-29 in einem experimentellen Leberfibrosemodell in vivo zu untersuchen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kwiecinski, Monika kw.monika@yahoo.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-42635
Date:	March 2011
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences Medical sciences Medicine
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language miRNA German Leberfibrose German
Date of oral exam:	23 May 2011
Referee:	Name Academic Title Nischt, Roswitha PD Dr. Hammerschmidt, Matthias Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4263