Universität zu Köln

Kuhn, Jennifer (2011). Molecular Genetics of Alopecia Areata in Dundee Experimental Bald Rats and in Humans. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Alopecia areata (AA) (MIM 104000) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des aktiv wachsenden Haarfollikels in der Anagenphase mit einer starken genetischen Komponente. Sie ist im Allgemeinen durch einen kreisrunden Haarverlust am Kopf oder aber auch an anderen Körperstellen charakterisiert. Die Krankheitsentstehung ist nach wie vor unklar wobei ein gewebespezifischer Autoimmunmechanismus vermutet wird. In dieser Studie wurde der Stamm Dundee Experimental Bald Rat (DEBR) als Nagetiermodell für AA verwendet. In vorhergehenden Arbeiten wurde eine Kreuzung von DEB mit PVG Ratten angesetzt aus der 320 weibliche F2 Tiere entstanden. Diese Tiere wurden genomweit mit Mikrosatelliten auf Kopplung getest, was zu einem hoch signifikanten Lokus auf Chromosom 19 mit einem lod score von 20 führte. In dieser Arbeit folgte daher eine Sättigungskartierung für dieses Chromosom mit weiteren Mikrosatellitenmarkern die eine Kandidatenregion bei 33 bis 36.5 Mb (rn4) identifizierte. Exone der meisten Gene innerhalb dieser Region wurden sequenziert wobei keine Mutationen, als potentielle Ursache für Haarausfall, identifiziert werden konnten. Daher wurde die komplette Kandidatenregion erneut mittels Next Generation Sequencing (NGS) sequenziert. Mutationen konnten damit weiterhin nicht identifiziert werden. Einige intergenetische Varianten suggerieren jedoch das Vorkommen von bisher unbekannten Genen innerhalb der Kandidatenregion oder es könnte sich um Mutationen in regulatorischen Elementen wie beispielsweise in Promotor- oder Enhancerregionen handeln. Dies muss in weiteren bioinformatischen Berechnungen geklärt werden. Zusätzlich zur Sequenzierung wurde ein weiterer Ansatz über die Expressionsanalyse mittels Affymetrix GeneChip Rat Gene 1.0 ST Arrays verfolgt. Diese ließ Abweichungen in der Expression von verschiedenen (Haar-) Keratingenen, Genen von weiteren strukturellen Komponenten sowie immunregulatorische Gene wie Chemokine und H2 Gene, die ortholog zu HLA sind, erkennen. Weitergehende Auswertungen der Expressionsdaten von Genen der Kandidatenregion auf Chromosom 19 mit dem Programm „Network Explorer“ von Ingenuity Pathways Analysis verwiesen auf eine wichtige Rolle von Cadherinen. Daher wurde ein Set aus Cadherinen, Cateninen und Desmogleinen immunohistochemisch in Hautproben gefärbt. Dieses Experiment zeigte eine Reduzierung in der Konzentration von Catenin gamma in Korrespondenz zum Phänotyp. In Proben von Ratten mit einem ausgeprägten Haarverlust war Catenin gamma nicht mehr nachweisbar. Zusätzlich zu Catenin gamma zeigte M- und P-Cadherin ebenfalls eine abnormale Proteinlokalisierung in der humanen Epidermis der Haut. Die Resultate der Expressionsanalyse von Kandidatengenen wurden schließlich in Rattenhaut und teilweise auch in Herzproben mittels qRT-PCR (Light Cycler 480 System von Roche) validiert und verfeinert. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse und der Färbungen weisen auf eine Beteiligung des Wnt/Catenin beta Signalweges und einem Defekt in den Zell-Zell-Verbindungsstrukturen in der Krankheitsentwicklung von Alopezie hin. Im nächsten Schritt werden immunohisto-chemische Färbungen in Rattenhaut in verschiedener Stadien von Haarverlust wiederholt und elektronenmikroskopisch untersucht, wobei der Fokus auf Desmosomen der Haarfollikel und der Epidermis liegt, um ein tiefergehendes Verständnis in die strukturellen Defekte der Zell-Zell-Verbindungskomplexe und dem Zeitpunkt der Zerstörung zu bekommen. Eine genomweite Kopplungsanalyse mit SNP Marker wurde im Vorfeld zu dieser Studie mit humanen Proben durchgeführt, die auf einen signifikanten Lokus auf Chromosom 19 verwies. Im Rahmen dieser Studie wurde eine Feinkartierung dieses Lokus auf Chromosom 19 in 301 Familien (1131 Individuen) mittels SNPstream, Taqman und Pyrosequencing durchgeführt. Eine Kopplungsanalyse identifizierte eine Kandidatenregion bei 37 bis 38 Mb (GRCH37), welche mehrere Zinkfingergene beinhaltet. Die höchsten nichtparametrischen lod scores wurden für SNPs in oder nahe der Gene ZNF567 und ZNF568 erzielt. Daher wurden diese Gene auf Mutationen mittels Schmelzkurvenanalyse und Sequenzierung untersucht. Es konnten keine Mutationen gefunden werden, da alle aufgetretenen Varianten auf bekannte SNPs zurückzuführen sind. Zusätzlich wurden für eine SNP basierte genomweite Assoziationsstudie (GWAS) mit 357 Fällen und 2534 Kontrollen weitere Proben gesammelt und mit Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 genotypisiert. Signifikante assoziierte Loci wurden für die Chromosomen 5, 6 (welches die HLA Region beinhaltet) und 16 (CLEC16A) ausfindig gemacht. Außerdem resultierte eine Kopplungsanalyse mit 259 Familien mit 855 Individuen in einer signifikanten Region auf Chromosom 10 und 19 (Zinkfingerregion). Mit einer definierten Auswahl an SNP Marker wurde eine Kandidatenregion bei 35.9 Mb bis 36.5 Mb (GRCH37) auf Chromosom 19 identifiziert. In einem nächsten Schritt wird die kombinierte Region von 35.9 Mb bis 38 Mb in Gänze mit NGS sequenziert und nach Mutationen untersucht. Abschließend weist die vorliegende Studie auf eine starke Assoziation von zellulären Defekten in der Haut mit der Krankheit hin, was in weiterführenden Experimenten mit dem Rattenmodell DEBR in der Dermatogenetikgruppe des CCG weitergehend untersucht werden wird. Zusätzlich zu den bereits bekannten immunoregulatorischen Genen, die mit AA assoziiert sind, konnte diese Studie signifikante Kopplungsbefunde für Loci auf Chromosom 10 und besonders für Chromosom 19, welche ein Zinkfingercluster beinhaltet, ausfindig machen. Diese Resultate machen erneut deutlich, dass mehrere komplexe Mechanismen zu der Suszeptibilität der Krankheit beitragen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Alopecia areata (AA) (MIM 104000) is a chronic inflammatory, multifactorial disorder of the hair follicles in the actively growing anagen stage with a strong genetic basis. It is typically characterized by circular regions of hair loss on the head or also on other parts of the body. The pathogenesis of the disorder is still unknown but a tissue-specific auto immune mechanism of disease has been suggested. In this study, the Dundee Experimental Bald Rat (DEBR) was used as a rodent model of AA. An intercross of DEB with PVG rats gave rise to 320 female F2 rats with which a whole genome scan for linkage with microsatellite markers was performed prior to this study that resulted in one highly significant locus on chromosome 19 with a lod score of 20. In this study saturation mapping of this chromosome with more microsatellite markers was conducted which identified a candidate region at 33 to 36.5 Mb (rn4). Exons from most genes within this region were sequenced. Mutations could not be detected as a potential cause for hair loss. Therefore the candidate region was sequenced again in toto by Next Generation Sequencing (NGS). Mutations could still not be identified but lots of intergenic variations suggest the existence of unknown genes within that region or there might be a mutation in a regulatory element of a gene as for example in the promoter or enhancer region. This will have to be checked by further bioinformatic analyzes. In addition to the sequencing another approach included an expression analysis using Affymetrix GeneChip® Rat Gene 1.0 ST Arrays. This revealed expression differences for various (hair) keratin genes and genes of other structural components, immunoregulatory genes such as chemokines, and H2 genes, the HLA orthologs. Further analysis of the expression data from genes of the candidate region on chromosome 19 with the network explorer tool from Ingenuity Pathways Analysis pointed to an important role of cadherins. Therefore a set of cadherins, catenins, and desmogleins were immunohistochemically stained in skin samples. This experiment showed a decrease in catenin gamma concentration corresponding to the phenotype. In samples of rats with a severe hair loss catenin gamma was no longer detectable at all. These histological findings could also be seen in rat heart samples and in human skin. In addition to catenin gamma, M- and P-cadherin also showed abnormal protein localizations in the epidermeis of human skin. The expression results of suggestive genes were then validated and refined in rat skin and partially also in heart samples with qRT-PCR using the LightCycler 480 System from Roche. The expression and staining results point to an involvement of the Wnt/catenin beta signaling pathway and a defect in the cell-cell adherens structures in the pathology of alopecia. In the next step immunohistological stainings will be repeated in rat skin of different stages of hair loss and looked at with electron microscopy, focusing on desmosomes in hair follicles and the epidermis to obtain further insight into the defective structure of cell-cell-adhesion complexes and the timepoint of destruction. A whole-genome scan for linkage with SNP markers was performed with human samples prior to this study showing one significant locus on chromosome 19. Further fine mapping of the locus on chromosome 19 in 301 families (1131 individuals) was performed in this study with SNPstream, Taqman, and Pyrosequencing. Linkage analysis identified a candidate interval in the region between 37 Mb to 38 Mb (GRCH37) including several zinc finger genes. Highest non parametric lod scores were obtained for SNPs in or near the genes ZNF567 and ZNF568. Therefore these genes were screened for mutations with high resolution melting curve analysis and sequencing. No mutations could be found since all detected variations were due to known SNP markers. In addition more samples were collected and genotyped with Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 for a SNP based genome-wide association study (GWAS) including 357 cases and 2534 controls. Significantly associated loci were found on chromosomes 5, 6 (including the HLA region), and 16 (CLEC16A). Linkage analysis with 259 families (855 individuals) furthermore resulted in significant regions on chromosomes 10 and 19 (zinc finger region). With a defined set of SNP markers a candidate region at 35,9 Mb to 36,5 Mb (GRCH37) on chromosome 19 could be identified. In the next step the combined region of 35,9 Mb to 38 Mb (GRCH37) will be sequenced in toto by NGS and screened for mutations. In conclusion, this study shows a strong association of cellular defects in the skin with the disease which will be further addressed in future experiments with the rat model DEBR in the dermatogenetics group of the CCG. In addition to the already known immunoregulatory genes associated with AA, this study also revealed significant linkage results for loci on chromosome 10 and even more so for chromosome 19, including a zinc finger cluster. These results point out anew that several complex mechanisms contribute to the disease susceptibility. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Kuhn, Jennifer jenniferkuhn@o2online.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-42764
Date:	2011
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Natural sciences and mathematics Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Alopecia areata English Alopezia areata German
Date of oral exam:	28 June 2011
Referee:	Name Academic Title Nürnberg, Peter Prof. Dr. Nögel, Angelika Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/4276